Mikroszkópos képalkotó tanterem 丨Fluoreszcens mikroszkóp alkalmazása
A teljes belső reflexiós fluoreszcencia mikroszkóp (TIRFM) egy olyan technika, amely a két különböző törésmutatójú közeg között terjedő fénysugár által generált evanszcens hullámot használja fel a fluoreszcensen jelölt élő sejtek felszínének vizsgálatára. A gyakorlatban, amikor egy beeső lézersugár találkozik a fedőlemez és a sejteket tartalmazó vizes közeg közötti határfelülettel, az a kritikus szögben verődik vissza (teljes belső visszaverődés). Mivel az evaneszcens hullám energiája exponenciálisan csökken a fedőlemeztől való távolsággal, csak a felület 10 nanométeres körzetében (10 és 200 nanométer között) lévő fluoroforokat gerjeszti az evaneszcens hullám, míg a távolabbi fluoroforokat nagyrészt nem gerjeszti. Érintett. Így a TIRFM magas jelszintet eredményez a fedőlemez közelében elhelyezett, nagyon sötét háttérre ráhelyezett fluoroforokból, kiváló jel-zaj arányt biztosítva. A gerjesztési mélység szélsőséges korlátja ideális egyedi molekulák vagy membrán- és organellum-összetétel tanulmányozásához a fedőlemez felületéhez közeli tapadó sejtekben (lásd a 8(e) ábrát). Mivel a gerjesztés a fedőlemez közelében lévő vékony területekre korlátozódik, a fényfehérítés és a fototoxicitás is ezekre a területekre korlátozódik, így a TIRFM az egyik leghasznosabb módszer a hosszú távú megfigyeléshez. A technika a sejt- és molekuláris biológia számos jelenségének tanulmányozásának alapvető eszközévé vált.
A dekonvolúció egy olyan algoritmus, amelyet az optikai (Z) tengely mentén készített, teljesen fókuszos képek halmazára alkalmaznak, hogy fokozzák a fotonjelet egy képhalmazban egy adott képsíkra vagy több fókuszsíkra vonatkozóan. A mikroszkópokat nagy pontosságú motoros fókuszmeghajtókkal kell felszerelni, hogy garantálják a képalkotást a minta fókuszsíkjai között pontosan meghatározott időközönként. Egy tipikus alkalmazásban (lásd a 8(f) ábrát) a dekonvolúciós eljárást arra használják, hogy elmossák és eltávolítsák a fókuszon kívüli fényt egy adott fókuszsíkról széles látómezős fluoreszcens gerjesztés és emisszió segítségével. A legbonyolultabb alkalmazás a dekonvolúciós folyamat alkalmazása a teljes képhalomra vetített nézetek vagy 3D modellek létrehozásához. A dekonvolúcióhoz használt széles látómezős képek halmaza rögzíti a minta által kibocsátott fotonok elméleti maximális számát. A dekonvolúciós folyamat a fókuszsík felett és alatt kibocsátott fotonok "elmosódott" intenzitását visszaosztja az eredeti síkra. Így a dekonvolúció szinte az összes rendelkezésre álló kibocsátási intenzitást felhasználja, és optimális fényköltséget biztosít, így ez a technika a nagyon fényérzékeny minták választott módszere.
A rezonanciaenergia-transzfer jelenség fluoreszcencia-mikroszkópos, fluoreszcens vagy Förster-rezonancia-energiatranszfer (FRET) egy változatát használják kvantitatív időbeli és térbeli információk megszerzésére a fehérjék, lipidek, enzimek és nukleinsavak élő sejtekben történő kötődéséről és kölcsönhatásáról. A FRET alkalmazhat állandó állapotú vagy időfelbontású technikákat, de az időfelbontású FRET képalkotás előnye, hogy pontosabban leképezi a donor-akceptor távolságokat. A FRET képalkotáshoz szabványos széleslátószögű fluoreszcens mikroszkóp használható megfelelő gerjesztési és emissziós szűrőkkel és érzékeny kamerával. A sejtbiológiában jelenleg széles körben alkalmazzák azokat a bioszenzorokat, amelyek egy környezetre érzékeny fehérjét vagy peptidet szendvicseznek két FRET-alkalmazható fluoreszcens fehérje közé. Ezek a szondák könnyen leképezhetők széles látóterű fluoreszcens mikroszkóppal, szenzitizált emissziós FRET technikák és ratiometrikus elemzéssel kombinálva. Ezenkívül a spektrális képalkotás és a lézeres pásztázó konfokális mikroszkóppal történő lineáris feloldás segíthet a FRET-jelenségek nyomon követésében bioszenzorokban és más fluoreszcens fehérje alkalmazásokban.
A fluoreszcens élettartam képalkotó mikroszkópia (FLIM) egy kifinomult technika, amely képes egyidejűleg rögzíteni a fluoreszcencia élettartamát és a fluorofor térbeli elhelyezkedését a kép minden pontján. Ez a módszer olyan környezeti paraméterek vizsgálatára szolgál, mint a pH, ionkoncentráció, oldószer polaritás, nem kovalens kölcsönhatások, viszkozitás és oxigénfeszültség egyetlen élő sejtben, és az adatokat térbeli és időbeli tömbökben mutatja be. A gerjesztett állapotok élettartamának FLIM-mérései nanoszekundumos skálán függetlenek a helyi fluoroforkoncentrációktól, a fényfehérítő hatásoktól és az úthossztól (mintavastagság), de érzékenyek a gerjesztett állapotú reakciókra, például a rezonancia energiaátvitelére. Valójában a FLIM és a FRET kombinálása a fluoreszcens donorok élettartam-változásainak monitorozásával a rezonancia energiaátvitel előtt és után tekinthető az egyik legjobb módszer ennek a jelenségnek a tanulmányozására.
A fluoreszcensen jelölt makromolekulák és kisméretű fluoroforok mobilitása (transzverzális diffúziós koefficiense) fotofehérítés utáni fluoreszcencia-visszanyeréssel (FRAP) határozható meg. A FRAP-ban egy nagyon kicsi kiválasztott területet (néhány mikrométer átmérőjű) intenzíven megvilágítanak, általában lézerrel, hogy az adott területen a fluorofor teljes fényfehérítését eredményezze. Az eredmény a fluoreszcencia drámai csökkenése vagy megsemmisülése. A fényfehérítő impulzust követően a fehérített régiókban a fluoreszcencia intenzitás helyreállításának sebességét és mértékét az idő függvényében követtük alacsony gerjesztési intenzitás mellett, hogy információt kapjunk a fluoroforok újratelepülésének és helyreállításának kinetikájáról (9. ábra). A FRAP-ot általában EGFP vagy más fluoreszcens fehérjék segítségével hajtják végre. A kapcsolódó fotoaktivációs technikák speciális szintetikus ketrecbe zárt fluoroforokon vagy hasonló funkciójú fluoreszcens fehérjéken alapulnak, amelyek rövid UV- vagy ibolyaimpulzusokkal aktiválhatók. A fotoaktiválás és a FRAP kiegészítő technikaként használható a mobilitási paraméterek meghatározására.
A FRAP-hoz kapcsolódó technikában, amelyet fotofehérítés utáni fluoreszcens veszteségnek (FLIP) neveznek, egy élő sejtben meghatározott fluoreszcens régió intenzív besugárzással ismételt fényfehérítésen megy keresztül. Ha a mért időtartam alatt az összes fluorofor be tudna diffundálni a fényfehérítés alatt álló területre, ez a fluoreszcens jel teljes elvesztését eredményezné az egész sejtben. Ha kiszámítjuk, hogy a fluoreszcencia milyen sebességgel tűnik el az egész sejtből, meghatározható a célfluorofor diffúziós mobilitása. Ezen túlmenően, a FLIP könnyen azonosítani tudja a sejtek egyes kompartmentjei közötti diffúziós akadályok helyét és természetét, például egy neuron szóma és axonja közötti gátat.
A fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia (FCS), amelyet főként lézeres pásztázó konfokális mikroszkópiában vagy többfotonmikroszkópiában használnak, olyan kinetikai információk meghatározására szolgáló módszer, mint a kémiai reakciósebesség, diffúziós együtthatók, a molekulatömeg, az áramlási sebesség és az aggregáció technikái. FCS-ben egy kis térfogatot (körülbelül egy femtométer; a lézer diffrakciós fókusza) fókuszált lézersugárral világítanak meg, hogy rögzítsék a fluoreszcens molekulák dinamikája által kiváltott autofluoreszcens intenzitás-ingadozásokat a fluoreszcens sugárzás által elfoglalt térfogatban az idő függvényében. molekulák (10. ábra). A viszonylag kicsi fluoroforok gyorsan diffundálnak a megvilágított térfogatban, rövid, véletlenszerű intenzitású kitöréseket hozva létre. Ezzel szemben a nagyobb komplexek (makromolekulákhoz kötött fluorofórok) lassabban mozognak, hosszabb, tartósabb időfüggő fluoreszcenciaintenzitás-mintázatot hozva létre.
Ha a fluoreszcensen jelölt struktúrák sűrűn össze vannak csomagolva, és átfedésben vannak az élő sejtek meghatározott régióiban, akkor dinamikájukat és térbeli eloszlásukat nehéz elemezni. A fluoreszcens foltmikroszkópia (FSM) szinte minden képalkotó módszerrel kompatibilis technika, amely kihasználja a fluoreszcensen jelölt alegységek nagyon alacsony koncentrációját, csökkenti a fókuszon kívüli fluoreszcenciát, és javítja a jelölt struktúrák láthatóságát és dinamikáját vastag területeken. Az FSM-eket úgy valósítják meg, hogy a teljes érdeklődésre számot tartó szerkezetnek csak egy töredékét címkézik fel. Ebben az értelemben az FSM hasonló az FCS végrehajtásához a teljes látómezőben, bár nagyobb hangsúlyt fektet a térbeli mintákra, nem pedig a kvantitatív időbeli elemzésre. A fluoreszcens foltmikroszkópia különösen hasznos a citoszkeletális elemek, például az aktin és a mikrotubulusok mobilitásának és aggregációjának meghatározásában hiperaktív sejtekben.
A stimulált emissziós kimerülési mikroszkópia (STED) egy feltörekvő szuperfelbontású technika, amelynek térbeli felbontása messze meghaladja a diffrakciós határt, és gyűrű alakú kimerült fényt vesz körül egy kisebb gerjesztő fénysugarat, hogy a tengelyen szub-50 nm-t kapjon. az állásfoglalást. A technika a fluoroforok gerjesztésére épül szinkronizált lézerimpulzusokkal és térben koordinált körkörös STED-impulzusokkal, amelyek kimerítik a kibocsátott fényt, elnyomva a gerjesztett molekulák fluoreszcenciáját a lézeres pásztázási fókusz körül. A folt perifériáján keletkező fluoreszcencia elnyomódik, de a folt közepén nem, így jelentősen csökken a fluoreszcens folt mérete és ennek megfelelően jelentősen megnő a felbontás. A STED hasznos eszköznek bizonyult az élő sejtek nagy felbontású kimutatására. Más feltörekvő szuperfelbontású technikák, mint például a fotoaktivált lokalizációs mikroszkóp (PALM) és a strukturált fénymegvilágítási mikroszkóp (SIM), szintén az élő sejtes képalkotás alapvető eszközeivé válnak a közeljövőben.
A genetikailag kódolt fluoreszcens fehérjék és a fejlett szintetikus fluoroforok növekvő használata az élősejtek képalkotásához új optikai módok előtt nyitja meg az ajtót az időbeli dinamika és a térbeli kapcsolatok monitorozására. A mikroszkóposok ma már egy teljes eszközkészlettel rendelkeznek a sejtfolyamatok képi adatainak megfigyelésére és rögzítésére, amelyek széles időskálán és többféle felbontás mellett zajlanak le. A lassabb események könnyen megfigyelhetők és rögzíthetők lézeres pásztázó konfokális mikroszkóppal, míg a gyorsabb kinetikai események a spinning disc technológiával érhetők el. Ezenkívül a multifoton mikroszkópia lehetővé teszi a mély képalkotást vastag szövetekben, a teljes belső reflexiós technikák pedig a membránfelületek konfokális pontosságú vizsgálatát. A fejlett fluoreszcens módszerek, mint például a FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM és STED, felhasználhatók a fehérje-fehérje kölcsönhatások monitorozására a diffrakciós határ által megengedettnél gyakran jobb felbontás mellett. A fluorofor, mikroszkóp és detektor technológia fejlődésével egy szélesebb világ kerül "mikroszkóp alá".
