A különbség a (kétfoton, konfokális) fluoreszcencia mikroszkóp és a szokásos mikroszkóp között
A kétfotonos gerjesztés alapelve az, hogy a nagy fotonsűrűségnél a fluoreszcens molekulák egyszerre képesek egyidejűleg felszívni a két hosszú hullámhosszú fotont, és rövidebb hullámhosszú fotont bocsátanak ki egy rövid időtartam után az úgynevezett gerjesztett állapot élettartama után; A hatás megegyezik a hosszú hullámhossz hullámhosszának felére, hogy a fluoreszcens molekulák izgatására használjon fotonot. A két foton gerjesztéshez nagy fotonsűrűség szükséges, és a káros sejtek elkerülése érdekében a kétfotonmikroszkópia nagy energiájú üzemmódú lezárt impulzusos lézereket használ. A lézer által kibocsátott lézer magas csúcsteljesítményű és alacsony átlagos energiával rendelkezik, az impulzusszélesség mindössze 100 femtosekundummal és 80–100 megahertz frekvenciával rendelkezik. Ha egy nagy numerikus rekesz objektív lencsét használ, hogy fókuszáljon egy impulzusos lézer fotonjait, a fotonsűrűség az objektív lencse fókuszpontjában a legmagasabb, és a két foton gerjesztés csak az objektív lencse fókuszpontjában fordul elő. Ezért a két fotonmikroszkóp nem igényel konfokális pinlyukot, amely javítja a fluoreszcencia detektálásának hatékonyságát.
Általános fluoreszcencia jelenségekben, a gerjesztő fény alacsony fotonsűrűségének köszönhetően, a fluoreszcens molekula csak egyszerre képes felszívni egy fotont, majd egy másik fluoreszcens fotont bocsát ki a sugárzó átmeneten keresztül, amelyet egyetlen foton fluoreszcencia néven ismertek. A fluoreszcencia gerjesztési folyamatokhoz lézerek fényforrásokként történő felhasználásával kétfoton vagy akár multiphoton fluoreszcencia jelenségek fordulhatnak elő. Ebben az esetben a felhasznált gerjesztő fényforrás nagy intenzitású és fotonsűrűséggel rendelkezik, amely megfelel annak a követelménynek, hogy a fluoreszcens molekulák egyidejűleg két fotont felszívódjanak. Az általános lézer gerjesztési fényforrásként történő felhasználása során a fotonsűrűség még mindig nem elegendő a két foton abszorpciós jelenség előállításához. Általában a femtosekundumos impulzusos lézereket használják, a pillanatnyi teljesítmény elérve a megawatt szintet. Ezért a kétfoton-fluoreszcencia hullámhossza rövidebb, mint a gerjesztő fényé, ami megegyezik a fél gerjesztési hullámhossz-gerjesztés által okozott hatásnak.
A konfokális fluoreszcencia mikroszkóppal kapcsolatos ismeretek
A konfokális fluoreszcencia mikroszkópia alapelve egy pont fényforrás felhasználása a minta besugárzására, és egy jól definiált kis fénypontot képez a fókusz síkon. Az objektív lencse összegyűjtötte az ebből a pontból kibocsátott fluoreszcenciát, és az eredeti besugárzási út mentén visszajuttatja a dikroikus tükörből álló gerenda osztóhoz. A spektrométer fluoreszcenciát közvetlenül az detektorhoz továbbít. A fényforrás és a detektor előtt van egy pinlyuk, az úgynevezett megvilágító pinlyuk és a detektáló pinlyuk. A kettő geometriai dimenziói következetesek, megközelítőleg 100-200 nm; A fókusz sík fénypontjához képest a kettő konjugált, ami azt jelenti, hogy a könnyűfolt egy sor lencsén keresztül halad át, és végül mind a megvilágítási, mind a detektálási pinlyukra összpontosíthat. Ilyen módon a fókusz síkból származó fény konvergálhat a detektálási lyuk tartományában, míg a fókusz sík fölött vagy alá szétszórt fényt a detektálási lyukon kívül blokkolják, és nem lehet képzelni. A minta pontról pontról lézerrel történő beolvasásával a fotomultiplier cső a pinlyuk észlelése után a fénypont pontjának megfelelő konfokális képét is megkapja, átalakítja azt digitális jelévé, és továbbítja a számítógépre, és végül a képernyőn a teljes fókuszos sík tiszta konfokális képévé teszi.
