A fluoreszcens mikroszkópok elve és szerkezeti jellemzői
A fluoreszcens fényforrás általában ultra-nagynyomású higanylámpát (50–200 W) használ, amely különböző hullámhosszúságú fényt bocsát ki. Azonban minden fluoreszcens anyagnak van egy meghatározott gerjesztési hullámhossza, amely intenzív fluoreszcenciát generál. Emiatt szükség van egy gerjesztő szűrőre (jellemzően ultraibolya, ibolya, kék és zöld színben kapható), hogy csak meghatározott hullámhosszú gerjesztő fényt engedjen át és besugározza a mintát, miközben az összes többi hullámhosszt elnyeli.
Gerjesztő fénnyel besugározva minden anyag rendkívül rövid időn belül a gerjesztő fényénél hosszabb hullámhosszú látható fluoreszcenciát bocsát ki. A fluoreszcencia nagyon specifikus és általában gyengébb, mint a gerjesztő fény. Ennek a specifikus fluoreszcenciának a megfigyeléséhez egy záró (vagy elnyomó) szűrőt kell felszerelni az objektívlencse mögé. Két célt szolgál: először is elnyeli és blokkolja a gerjesztő fény bejutását a szemlencsébe, hogy elkerülje a fluoreszcencia megfigyelését és a szem károsodását; másodszor, szelektíven továbbítja a specifikus fluoreszcenciát, hogy külön fluoreszkáló színt hozzon létre. A kétféle szűrőt ki kell választani és egyező párban kell használni.
A fluoreszcens mikroszkópokat optikai útjuk alapján két típusra osztják:
1. Átbocsátott fény fluoreszcens mikroszkóp
Ebben a kialakításban a gerjesztő fényforrás áthalad a kondenzátoron és a mintaanyagon, hogy gerjeszti a fluoreszcenciát. Általában sötét mezős kondenzátort használnak, bár szabványos kondenzátor is alkalmazható; a visszaverő tükör úgy van beállítva, hogy a gerjesztő fényt átirányítsa és oldalról besugározza a mintára. Ez egy viszonylag régebbi típusú fluoreszcens mikroszkóp. Előnye az erős fluoreszcencia kis nagyításnál, míg hátránya, hogy a fluoreszcencia intenzitása a nagyítás növekedésével csökken. Ezért alkalmasabb nagyobb mintaanyagok megfigyelésére.
2. Epifluoreszcens mikroszkóp
Ez egy modern, újonnan kifejlesztett típusú fluoreszcens mikroszkóp. Az áteresztett fény kialakításától eltérően a gerjesztő fényt az objektívlencsén keresztül lefelé vetítik a minta felületére - ugyanaz az objektív szolgál megvilágítási kondenzátorként és fluoreszcenciát gyűjtő objektívként is. Az optikai pályán az optikai tengellyel 45 fokos szögben dikroikus sugárosztó van beépítve. A gerjesztő fény visszaverődik az objektívlencsén, és a mintára fókuszál. A minta által generált fluoreszcencia az objektívlencse és a fedőlemez felületéről visszaverődő gerjesztő fénnyel együtt egyszerre jut be az objektívlencsékbe és tér vissza a dikroikus nyalábosztóba, amely elválasztja a gerjesztő fényt a fluoreszcenciától. A fennmaradó gerjesztő fényt ezután a gátszűrő elnyeli.
A szűrőblokkok gerjesztőszűrő, dikroikus nyalábosztó és gátszűrő különböző kombinációival történő felcserélésével a különböző fluoreszcens reakciótermékekre vonatkozó követelmények teljesíthetők. Az ilyen típusú fluoreszcens mikroszkóp előnyei közé tartozik az egyenletes térmegvilágítás, az éles képalkotás és a fluoreszcens intenzitás növelése nagyobb nagyításnál.
