A fluoreszcens mikroszkópia elve és alkalmazása
(1) A fluoreszcens mikroszkóp elve és szerkezeti jellemzői: a fluoreszcens mikroszkóp nagy fényhatékonyságú pontszerű fényforrást használ, hogy bizonyos hullámhosszúságú fényt bocsát ki (például 3650 hüvelykes ultraibolya fényt vagy 4200 hüvelykes lila kék fényt) a szűrőrendszeren keresztül. mint a gerjesztő fény a minta gerjesztésére. Miután a benne lévő fluoreszkáló anyag különböző színű fluoreszcenciát bocsát ki, az objektívlencse és a szemlencse nagyításán keresztül figyelhető meg. Ily módon erős kontrasztos háttér alatt, még akkor is, ha a fluoreszcencia nagyon gyenge, könnyen azonosítható és nagy érzékenységgel rendelkezik. Főleg a sejtszerkezet és -funkció, valamint a kémiai összetétel kutatására használják. A fluoreszcens mikroszkóp alapszerkezete egy közönséges optikai mikroszkópból és néhány kiegészítőből áll (például fluoreszcens fényforrás, gerjesztő szűrő, kétszínű nyalábosztó és blokkoló szűrő stb.). Fluoreszkáló fényforrás - általában ultranagy nyomású higanylámpát (50-200W) használnak, amely különböző hullámhosszú fényt bocsát ki, de minden fluoreszcens anyagnak van egy olyan gerjesztési hullámhossza, amely a legerősebb fluoreszcenciát produkálja, ezért szükséges egy gerjesztő szűrő (Általában vannak ultraibolya, lila, kék és zöld gerjesztő szűrők), amelyek csak egy bizonyos hullámhosszú gerjesztő fényt engednek át és besugározzák a mintát, miközben más fényt nyelnek el. Az egyes anyagok gerjesztőfénnyel történő besugárzása után nagyon rövid időn belül látható fluoreszcenciát bocsátanak ki a besugárzási hullámhossznál hosszabb hullámhosszal. A fluoreszcencia specifikus és általában gyengébb, mint a gerjesztő fény. A specifikus fluoreszcencia megfigyeléséhez blokkoló (vagy elnyomó) szűrőre van szükség az objektívlencse mögött. Két funkciója van: az egyik, hogy elnyeli és blokkolja a gerjesztő fényt, hogy bejusson a szemlencsébe, hogy ne zavarja a fluoreszcenciát és ne károsítsa a szemet; a másik az, hogy kiválasztjuk és átengedjük a specifikus fluoreszcenciát, egy meghatározott fluoreszcens színt mutatva. A két szűrőt együtt kell használni.
Kétféle fluoreszcens mikroszkóp létezik az optikai útjukat tekintve:
1. Transzmissziós fluoreszcenciás mikroszkóp: A gerjesztő fényforrás fluoreszcenciát gerjeszt a minta anyagán keresztül a gyűjtőlencsén keresztül. Általában sötét mezős kollektort használnak, és egy közönséges kollektor is használható a tükör beállítására úgy, hogy a gerjesztő fény átkerüljön és megkerülje a mintát. Ez egy régimódi fluoreszcens mikroszkóp. Előnye, hogy kis nagyításnál erős a fluoreszcencia, hátránya pedig az, hogy a fluoreszcencia a nagyítás növelésével csökken. Ezért jobb nagyobb mintaanyagok megfigyelésére.
2. Epi-fluoreszcens mikroszkóp Ez a modern időkben kifejlesztett új típusú fluoreszcens mikroszkóp. A különbség az, hogy a gerjesztő fény az objektívlencséről a próbatest felületére esik, vagyis ugyanazt az objektívet használják megvilágítási kondenzátorként és a fluoreszcencia gyűjtésére szolgáló objektívként. A fényútba dikroikus nyalábosztót kell hozzáadni, amely 45 fokos távolságra van a könnyű urántól. A gerjesztő fény visszaverődik az objektívlencsén, és összegyűjti a mintán. A minta által generált fluoreszcencia és az objektív lencse felületéről és a fedőüveg felületéről visszaverődő gerjesztő fény egyszerre jut be az objektívbe, és visszatér a kétszínű nyalábosztóba, hogy a gerjesztő fény legyen. Elkülönül a fluoreszcenciától , a maradék gerjesztő fényt a blokkoló szűrők elnyelik. Ha különböző gerjesztő szűrők/kétszínű nyalábosztók/blokkoló szűrők kombinációjára vált, a különböző fluoreszcens reakciótermékek igényei kielégíthetők. Az ilyen típusú fluoreszcens mikroszkóp előnye, hogy a látómező megvilágítása egyenletes, a képalkotás tiszta, és minél nagyobb a nagyítás, annál erősebb a fluoreszcencia.
(2) A fluoreszcens mikroszkóp használata.
1. Kapcsolja be a fényforrást, az ultra-nagynyomású higanylámpának néhány percig fel kell melegednie, hogy elérje a legfényesebb pontot.
2. A transzmissziós fluoreszcens mikroszkóphoz a szükséges gerjesztő szűrőt a fényforrás és a kondenzátor közé, a megfelelő blokkoló szűrőt pedig az objektívlencse mögé kell elhelyezni. Az epifluoreszcens mikroszkópoknak be kell helyezniük a szükséges gerjesztőszűrőt/kettős színsugár-elosztót/blokkoló szűrőbetéteket a fényútban lévő résekbe.
3. Alacsony nagyítású lencsével figyelje meg, és állítsa be a fényforrás közepét a különböző típusú fluoreszcens mikroszkópok beállító eszközének megfelelően úgy, hogy az a teljes megvilágítási pont közepén legyen.
4. Helyezze el a mintalapot, és fókuszálás után figyelje meg. Használat közben figyelni kell: Ne figyelje közvetlenül a végszűrővel, hogy ne károsítsa a szemet; a minta olajlencsével történő megfigyelésekor speciális, fluoreszcencia nélküli olajlencsét kell használni; a nagynyomású higanylámpa kikapcsolása után nem lehet azonnal újra bekapcsolni, tesztelni kell. 5 perc után újraindítható, különben instabil lesz és befolyásolja a higanylámpa élettartamát.
(3) Megfigyelés Kék-lila fényszűrőt használva fluoreszcens mikroszkóp alatt a tanítási platformon látható, hogy az 0,01 százalékos akridinnarancssárga fluoreszcens festékkel megfestett sejteket, a sejtmagot és a citoplazmát gerjesztik, hogy két különböző színt állítsanak elő. fluoreszcens (sötét) zöld és narancsvörös).
