Többfoton mikroszkópos képalkotás: különféle technikák a neuronok in vivo képalkotására
A hagyományos egyfoton széles látómezős fluoreszcens mikroszkóppal összehasonlítva a multifoton mikroszkóp (MPM) optikai metszet és mély képalkotás funkcióval rendelkezik. 2019-ben Jerome Lecoq et al. három aspektusból tárgyalta a kapcsolódó MPM technológiát: az agy mélyén lévő neuronok leképezése, a masszív neuron-leképezés és a nagy sebességű neuron-leképezés.
Ahhoz, hogy a neuronok aktivitását a komplex viselkedéssel összekapcsolhassuk, általában szükség van a mély kéreg neuronjainak leképezésére, ami megköveteli, hogy az MPM képes legyen mély képalkotásra. A gerjesztő és emissziós fényt erősen szétszórja és elnyeli a biológiai szövet, ami a fő tényező, amely korlátozza az MPM képalkotási mélységét. Bár a szórási probléma megoldható a lézerintenzitás növelésével, ez más problémákat is hoz, mint például a minta elégetése, a defókuszálás és a felületközeli fluoreszcens gerjesztés. Az MPM képalkotás mélységének növelésének legjobb módja, ha hosszabb hullámhosszakat használunk gerjesztő fényként.
Ráadásul a kétfoton (2P) képalkotásnál a fókuszon kívüli és a felszínhez közeli fluoreszcencia gerjesztés a két legnagyobb mélységkorlátozó tényező, míg a háromfotonos (3P) képalkotásnál ez a két probléma jelentősen csökken, de háromfotonos képalkotás a fluoreszcenciának köszönhetően A csoport abszorpciós keresztmetszete jóval kisebb, mint a 2P-é, ezért egy nagyságrenddel nagyobb impulzusenergia szükséges ahhoz, hogy ugyanolyan intenzitású fluoreszcenciajelet kapjunk, mint a 2P által gerjesztett. A funkcionális 3P mikroszkópia igényesebb, mint a strukturális 3P mikroszkópia, amely gyorsabb letapogatást igényel a neuronális aktivitás időben történő mintavételéhez; nagyobb impulzusenergiára van szükség ahhoz, hogy elegendő jelet gyűjtsünk az egyes pixelek tartózkodási idején belül.
Az összetett viselkedések gyakran nagy agyi hálózatokat foglalnak magukban, helyi és hosszú távú kapcsolatokkal. Ahhoz, hogy a neuronok aktivitását a viselkedéssel összekapcsolhassuk, nagyon nagy és széles körben elterjedt neuronok aktivitásának egyidejű monitorozása szükséges. Az agy neurális hálózata több tíz ezredmásodperc alatt dolgozza fel a beérkező ingereket. Ennek a gyors neurális hálózatnak a megértéséhez Az idegsejtek dinamikájának tanulmányozásához az MPM-nek képesnek kell lennie a neuronok gyors leképezésére. A gyors MPM módszerek egysugaras szkennelési technikákra és többsugaras szkennelési technikákra oszthatók.
Az egysugaras szkennelési technológia lehetővé teszi az idegszövet nagy sebességű bejárását nagy látómezővel (FOV)
Amikor MPM-et használunk neuronok leképezésére, a véletlen hozzáférésű szkennelés – vagyis a lézersugarat a teljes látómező bármely kiválasztott pontján gyorsan letapogatja – csak a kérdéses neuronokat tudja letapogatni, ami nem csak a jelöletlen idegrostok szkennelését elkerüli. optimalizálja a lézersugár pásztázási idejét is. A véletlen hozzáférésű letapogatás (1. ábra) egy akusztooptikai terelővel (AOD) valósítható meg, amely úgy működik, hogy egy rádiófrekvenciás jellel ellátott piezoelektromos jelátalakítót egy megfelelő kristályhoz kötünk. A keletkező akusztikus hullámok periodikus törésmutató rácsot indukálnak. Diffrakció akkor következik be, amikor a lézersugár áthalad egy rácson. A hanghullám intenzitása és frekvenciája rádiófrekvenciás elektromos jellel állítható a szórt fény intenzitásának és irányának megváltoztatásához, így egy AOD használatával egydimenziós vízszintes tetszőleges pontszkennelés valósítható meg, és 3D is megvalósítható. egy pár AOD használatával kombinálva más axiális szkennelési technológiákkal, véletlen hozzáférésű szkenneléssel. Ez a technika azonban nagyon érzékeny a minta mozgására, és hajlamos a mozgási műtermékekre. Jelenleg a gyors raszteres pásztázást, vagyis a progresszív letapogatást FOV-ban széles körben alkalmazzák, mert az algoritmus könnyen meg tudja oldani a mozgási műtermékeket.
A neokortikális L2/3 neuronok AOD-alapú kétfoton képalkotása in vivo[2]
A gyors raszteres letapogatás megvalósításának számos módja van, rezgőtükör használata a gyors 2D szkenneléshez, rezgőtükör és állítható elektromos lencse kombinálása a gyors 3D szkenneléshez, de az állítható elektromos lencse nem tud gyorsan tengelyirányban fókuszálni a korlátok miatt. mechanikai tehetetlenség A képalkotás sebességét befolyásoló kapcsolást most térbeli fénymodulátorral (SLM) lehet helyettesíteni.
A távfókuszálás is egy eszköz a 3D képalkotás megvalósítására, amint az a 2. ábrán látható. Az LSU modulban a pásztázó galvanométer vízszintesen pásztáz, az ASU modul tartalmazza az L1 objektívlencsét és az M tükröt, az axiális szkennelés pedig beállítással valósul meg. Ezzel a technikával nemcsak az L2 fő objektívlencse által okozott optikai aberrációt lehet korrigálni, hanem gyors axiális pásztázást is lehetővé tesz. Több neuron képalkotás érdekében a FOV a mikroszkóp objektívlencséjének kialakításával növelhető, de a nagy NA-val és nagy FOV-val rendelkező objektívlencse általában nehéz, és nem tud gyorsan mozogni a gyors axiális pásztázáshoz, ezért a nagy FOV-rendszerek a telefókuszra támaszkodnak. , SLM és állítható motoros lencsék.
Távoli fókuszáló kétfoton képalkotó rendszer sematikus diagramja[3] A többsugaras szkennelési technológia képes egyidejűleg leképezni az idegszövet különböző pozícióit
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm távolságra) képalkotó helyek (3C., D. ábra); a szomszédos régiók esetében általában egyetlen objektívlencse több sugarát használja a képalkotáshoz (3E, F ábra). A többsugaras pásztázási technikánál különös figyelmet kell fordítani a gerjesztő nyalábok közötti áthallás problémájára, amely utólagos fényforrás elválasztási módszerrel vagy tér-idő multiplexeléses módszerrel oldható meg. A post-hoc fényforrás-leválasztási módszer a nyalábok szétválasztására szolgáló algoritmusok alkalmazására vonatkozik, hogy kiküszöbölje az áthallást; az idő-tér multiplexelési módszer több gerjesztő nyaláb egyidejű alkalmazására vonatkozik, az egyes nyalábok impulzusai időben késleltetettek, így a különböző nyalábokkal gerjesztett egyes nyalábok átmenetileg szétválaszthatók. fluoreszcens jel. Több nyaláb bevezetésével több neuron is leképezhető, de több nyaláb megnöveli a fluoreszcencia lecsengési idejének átfedését, ami korlátozza a jelforrások megkülönböztetésének képességét; a multiplexelés pedig negatívan befolyásolja az elektronikus eszközök munkasebességét. Magas követelmények; nagyszámú nyalábhoz nagyobb lézerteljesítmény is szükséges ahhoz, hogy egyetlen sugár közelítő jel-zaj arányát fenntartsák, ami könnyen szövetkárosodáshoz vezethet.
Nagy területű képalkotó technológia
Az elmúlt években a különböző MPM-technológiák fejlesztése kibővítette az idegszövetek képalkotásának hatókörét, lehetővé téve számunkra, hogy az agy mélyén lévő neuronokat gyorsabban leképezzük, ami nagymértékben elősegítette az idegtudományi kutatásokat, és lehetővé tette számunkra, hogy tisztább megértést nyerjünk. az agyműködésről.
