Lézeres konfokális mikroszkópia – Jellemzők és alkalmazások
A lézeres pásztázó konfokális mikroszkóp (LSCM) egy olyan mikroszkóp típus, amely konjugált fókusztechnológián alapul, vagyis a lézerfényforrás, a mérendő minta és a detektor mind konjugált helyzetben vannak egymással.
Alapvető
Általános mikroszkópban a megfigyelési képsíkot a szomszédos axiális síktól úgy választják el, hogy az objektív lencse fókuszsíkját egybeesik a detektorral, míg a konfokális mikroszkópban egy diffrakció-korlátozott fényfoltot használnak a minta megvilágítására és A. A pinhole-t a fényfolt konjugált fókuszában összegyűjtött fényútban használják a szórt fény kiszűrésére, hogy létrehozzák ezt az izolációs hatást, és ezáltal javítsák a felbontást.
Képalkotási funkciók
Optikai metszetszkennelés képalkotás
A lézeres pásztázó konfokális mikroszkópia másik jellemzője, hogy pásztázó képalkotási technológia. A hagyományos széles látómezős megvilágítási technológia a teljes mintát megvilágítja, így a kép szabad szemmel vagy detektorral közvetlenül rögzíthető, de az LSCM nyalábot használ, vagy több fókuszált sugár halad át a mintán a szkenneléshez és a képalkotáshoz. Az így kapott képet optikai metszetnek nevezzük. Az alábbiakban bemutatjuk a különbséget a hagyományos széles látómezős megvilágítási módszer és a lézeres pásztázó konfokális megvilágítási módszer között.
Ezért egy modern konfokális mikroszkóp tényleges munkamódszere az alábbi ábrán látható. A lézer által kibocsátott gerjesztő fény egy dikroikus tükörön halad át, és a minta x és y irányában pásztázik egy galvanométeren keresztül. A minta gerjesztése (vagy visszaverődése) a fény a lyukon keresztül jut be a PMT detektorba, és rögzítésre kerül, majd a rögzített szkennelt képet egy számítógép rekonstruálja a tényleges mintakép rekonstrukciója érdekében.
Generáljon "z-stack" képeket különböző fókuszsíkon
Csak a konjugált mintarétegről visszaverődő fény juthat át a gyűjtőfényútban lévő kis lyukon, és a fennmaradó irreleváns mintaréteg-visszaverődéseket a kis lyuk blokkolja. Ez jelentős felbontásjavulást eredményezhet. Ugyanazon vastag minta többdimenziós fluoreszcens mikroszkópiájának és konfokális mikroszkópiájának egymás melletti összehasonlítása. Ha egy sor kép készül különböző fókuszsíkban, akkor általában "z-stack"-ként emlegetett képek hozhatók létre, amelyek szemléltetik a konfokális mikroszkópia által kínált felbontás- és kontrasztnövekedést, valamint e növekedések mögöttes okait. Látható, hogy a halom tetején lévő képet a szövet feletti képalkotó síkkal vizsgálva nagy mennyiségű szórt fény látható a fluoreszcens képen, míg a konfokális mikroszkópos kép feketének tűnik. Az axiális PSF ezen csökkenése közvetlenül eredményezi a z-verem közepén lévő optikai interfésznél megfigyelt felbontásbeli különbséget.
A felbontás nagymértékben jobb a széles látómezős világításhoz képest
A fluoreszcens mikroszkópban az egyetlen pontból kibocsátott fényintenzitást a pontszórási függvény (PSF) írja le, mintázata pedig egy Airy korong. A fluoreszcencia rendszer felbontása az Airy korong sugarával írható le, amely leírható: Az objektívlencse numerikus apertúrája és a gerjesztő fény hullámhossza határozza meg
