A két{0}}foton fluoreszcencia mikroszkóppal kapcsolatos ismeretek
A két{0}}fotonos gerjesztés alapelve az, hogy nagy fotonsűrűség mellett a fluoreszcens molekulák egyidejűleg képesek két hosszú hullámhosszú fotont elnyelni, és egy rövidebb hullámhosszúságú fotont bocsátani ki egy rövid, -ún. gerjesztett állapotú élettartam után; A hatás ugyanaz, mintha a hosszú hullámhossz fele hullámhosszú fotont használnánk a fluoreszcens molekulák gerjesztésére. A kétfotonos gerjesztéshez nagy fotonsűrűségre van szükség, és a sejtek károsodásának elkerülése érdekében a két-fotonmikroszkópia nagy-energiájú módú-zárt impulzuslézereket használ. A lézer által kibocsátott lézer magas csúcsenergiával és alacsony átlagos energiával rendelkezik, impulzusszélessége mindössze 100 femtoszekundum, frekvenciája pedig akár 80-100 megahertz. Ha nagy numerikus apertúrájú objektívlencsét használunk egy impulzuslézer fotonjainak fókuszálására, a fotonsűrűség az objektív gyújtópontjában a legmagasabb, és két{11}}fotonos gerjesztés csak az objektívlencse fókuszpontjában következik be. Ezért a két{13}}fotonos mikroszkóphoz nincs szükség konfokális tűlyukra, ami javítja a fluoreszcencia-detektálás hatékonyságát.
Általános fluoreszcens jelenségek esetén a gerjesztő fény alacsony fotonsűrűsége miatt egy fluoreszcens molekula egyszerre csak egy fotont képes elnyelni, majd sugárzási átmeneten keresztül egy másik fluoreszcens fotont bocsát ki, amit egyfoton fluoreszcenciának nevezünk. A lézereket fényforrásként használó fluoreszcens gerjesztési eljárásoknál két-foton vagy akár többfoton fluoreszcencia jelenség is előfordulhat. Ebben az esetben az alkalmazott gerjesztő fényforrás nagy intenzitással és fotonsűrűséggel rendelkezik, amely megfelel a fluoreszcens molekulák két foton egyidejű elnyelésének követelményének. Az általános lézer gerjesztő fényforrásként történő használata során a fotonsűrűség még mindig nem elegendő a két-foton abszorpciós jelenség kialakulásához. Jellemzően femtoszekundumos impulzuslézereket használnak, amelyek pillanatnyi teljesítménye eléri a megawatt szintet. Ezért a két-foton fluoreszcencia hullámhossza rövidebb, mint a gerjesztő fényé, ami egyenértékű a fél gerjesztési hullámhosszú gerjesztés hatásával.
