Bevezetés a fluoreszcens mikroszkópba
A fluoreszcencia mikroszkópia célja, hogy a fluoreszceinnel megfestett tárgyat rövid hullámhosszú fénnyel sugározzák be úgy, hogy hosszú hullámhosszú fluoreszcenciát állítsanak elő, majd megfigyeljék. Fluoreszcencia mikroszkópban a próbatest megvilágító fényéből egy meghatározott hullámhosszú gerjesztő fényt kell kiválasztani a fluoreszcencia generálásához, majd a fluoreszcenciát el kell választani a gerjesztő fény és a fluoreszcencia vegyes fényétől a megfigyeléshez. Ezért a szűrőrendszer rendkívül fontos szerepet játszik egy adott hullámhossz kiválasztásában. A fluoreszcens mikroszkópokat széles körben használják a biológiában, az orvostudományban és más területeken.
1. A fluoreszcens mikroszkóp fő összetevői:
(A) Fényforrás: A fényforrás különböző hullámhosszúságú fényt sugároz (az ultraibolya sugárzástól az infravörösig). a
(B) Gerjesztőszűrős fényforrás: meghatározott hullámhosszúságú fényen keresztül, amely a minta fluoreszcenciáját idézheti elő, miközben blokkolja a gerjesztő fluoreszcenciához haszontalan fényt. a
(C) Fluoreszcens minták: általában fluoreszcens pigmentekkel festve. a
(D) Blokkoló szűrő: blokkolja a gerjesztő fényt, amelyet a minta nem abszorbeál, és szelektíven továbbítja a fluoreszcenciát, és bizonyos hullámhosszakat szelektíven továbbítja a fluoreszcencia.
a
2. A fluoreszcens mikroszkópok osztályozása:
A fluoreszcens mikroszkópokat általában két típusra osztják: transzmissziós és epiemissziós:
a. Átviteli típus: a gerjesztő fény a vizsgálandó tárgy aljáról érkezik, a kondenzátor pedig egy sötét mezős kondenzátor, így a gerjesztő fény nem jut be az objektívbe, hanem a fluoreszcencia az objektívbe. Kis nagyításnál világos, nagy nagyításnál sötét. Olajmerítésben és központosításban nehézkes a működés. Kis nagyításnál különösen nehéz meghatározni a megvilágítási tartományt, de nagyon sötét látómező hátteret kaphat. Az átviteli típust nem használják nem átlátszó objektumokhoz. a
b. Epi-típus: A sebességváltó típus jelenleg szinte megszűnt. Az új fluoreszcens mikroszkópok többsége epi típusú. A fényforrás a vizsgálandó tárgy felülről érkezik, az optikai úton pedig sugárosztó található, így alkalmas átlátszó és átlátszatlan tárgyak vizsgálatára egyaránt. Mivel az objektív gyűjtőlencseként működik, nem csak egyszerűen kezelhető, hanem a teljes látómezőt egyenletesen megvilágítja az alacsony nagyítástól a nagy nagyításig. a
a
3. Óvintézkedések a fluoroszkópiával kapcsolatban
a. A gerjesztő fény hosszú távú besugárzása a fluoreszcencia gyengülését és kioltását okozza, ezért lehetőleg rövidítse le a megfigyelési időt, és ha átmenetileg nem figyel, használjon terelőlapot a gerjesztő fény lefedésére. a
b. Ha olajimmerziós lencsével figyel, használjon „nem fluoreszkáló olajat”. a
c. A fluoreszcencia szinte mindig gyenge, ezért sötét szobában kell elvégezni. a
d. A legjobb, ha feszültségstabilizátort szerelünk be a tápegységbe, különben az instabil feszültség nemcsak a higanylámpa élettartamát csökkenti, hanem a mikroszkópos vizsgálat hatását is befolyásolja. a
a
4. Fluoreszcens mikroszkóp használata
1. A fluoreszcens mikroszkóp minták előkészítési követelményei
a. Üveg csúszda
Az üveglemez vastagságának 0,8 és 1,2 mm között kell lennie. A túl vastag tárgylemez egyrészt több fényt nyel el, másrészt a gerjesztő fényt nem lehet a mintára koncentrálni. A tárgylemezeknek simának, egyenletes vastagságúnak és nyilvánvaló autofluoreszcenciától mentesnek kell lenniük. Néha kvarcüveg tárgylemezeket használnak. a
b. Takaróüveg
A fedőüveg vastagsága körülbelül 0,17 mm, sima. A gerjesztő fény erősítésére száraz fedőüveg is használható, amely több rétegű anyaggal (például magnézium-fluoriddal) bevont speciális fedőüveg, amelyek különböző interferencia hatást fejtenek ki a különböző hullámhosszúságú fényre, ami a a fluoreszcencia simán megy. A gerjesztő fény áthalad, és a visszavert gerjesztő fény gerjeszti a mintát. a
c. Mintadarab
A szövetszeletek vagy más minták nem lehetnek túl vastagok. Ha túl vastag, akkor a gerjesztő fény nagy részét a minta alsó része fogyasztja el, míg az objektívlencse által közvetlenül megfigyelt felső rész nem gerjeszthető teljesen. Ezenkívül a sejtek átfedése vagy szennyeződések takarják el, ami befolyásolja az ítéletet. a
d. Szerelőszer
Rögzítőszerként általában glicerint használnak, amelynek nem lehet autofluoreszcenciája, színtelen és átlátszó, a fluoreszcencia fényereje pedig világosabb pH 8.{1}},5-nél, és nem könnyű gyorsan elhalványulni. Ezért glicerin és 0,5 mol/l karbonát-pufferoldat egyenlő arányú keveréke, amelynek pH-ja 90 és 9,5 között van, általában kötőanyagként használatos. a
e. tükör olaj
Általában immerziós olajat kell használni, amikor a mintákat sötétmezős fluoreszcens mikroszkóppal és olajimmerziós immerziós objektívekkel vizsgálja. A legjobb, ha speciális, nem fluoreszkáló tükörolajat használunk, ami szintén helyettesíthető a fent említett glicerinnel, illetve folyékony paraffin is használható, de a törésmutatója alacsony, ami kis mértékben befolyásolja a képminőséget.
