Hogyan választhatja ki a megfelelő konfokális mikroszkópot? Van valami konkrét módszer?
A konfokális mikroszkópiának több előnye van, mint a széleslátószögű mikroszkópnak. A konfokális mikroszkóppal képes a minták folyamatos optikai metszete, és kizárható a nem fókuszsíkokból származó jel interferencia. Emiatt valóban elterjedtebb a konfokális mikroszkópia alkalmazása. A piacon azonban egyre több konfokális mikroszkóp található. Hogyan válasszunk?
A konfokális mikroszkópiának több előnye van, mint a széleslátószögű mikroszkópnak. A konfokális mikroszkóppal folyamatos optikai metszeteket készíthetünk a mintákból, és kizárhatjuk a nem fókuszsíkokból származó jelinterferenciát. Emiatt a konfokális mikroszkópia valóban gyakoribb. A piacon azonban egyre több konfokális mikroszkóp található. Hogyan válasszunk? A konfokális mikroszkóp kiválasztásakor két alapvető és fontos szempontot kell figyelembe venni: a vizsgálni kívánt minta típusát (pl. fix vagy élő sejtek), valamint az elvégzendő vizsgálat típusát (pl. statikus vagy dinamikus sejtfolyamatok).
Rögzített sejtek konfokális képalkotása
A rögzített és festett sejtek vagy szövetek képalkotásához általában a lézeres pásztázó konfokális (LSCM) módszert választjuk. Ennek főként az az oka, hogy a rögzített elhalt sejtekből hiányoznak a gyors biológiai események az élő sejtekben, és jobban profitálhatnak az LSCM nagyobb térbeli felbontásából. Az LSCM képalkotás célja a minta lézerrel történő optikai szeletelése, és a szkennelési sebesség (a szkennelési tömbtükör sebességétől függően) általában 1 képkocka/mp. A hosszabb expozíciós idő a fényfehérítés nagyobb kockázatát jelenti, de a rögzített elhalt sejteknél az idő nem kritikus, és több kép készítésével átlagolhatjuk.
Élő sejtek konfokális képalkotása
Az élő sejtek képalkotása további védelmet igényel a barátságtalan környezetekkel szemben. A képalkotás során elsődleges szempontunk a sejtek életképességének és egészségének megőrzése. Az állandó hőmérsékletű fűtőelemek és perfúziós rendszerek elengedhetetlenek, különösen az időzített vizsgálatokhoz. A legtöbb ember az élő sejtek fiziológiai állapotát szabályozó gyors biokémiai eseményeket szeretné tanulmányozni, de ezek az események túl gyorsak a hagyományos LSCM-hez. Ezenkívül az LSCM-nek való hosszan tartó expozíció toxikus fénykárosodást is okozott a sejtekben. Ezért az élő sejtek képalkotásához speciális konfokális mikroszkópokra van szükség.
Az élő sejtek konfokális képalkotására általában két lehetőség van: a gyors pásztázó lézeres pásztázó konfokális és a forgó lemezes konfokális képalkotás. A gyors pásztázó konfokális mikroszkóp a lassabb galvanométeres tükröket gyorsabb rezonáns pásztázási tükrökre cseréli, így akár 30 képkocka/mp pásztázási sebességet tesz lehetővé; míg a spinning disk confokális (SDCM) előnye a gyorsabb szkennelés (bár elkerülhetetlenül veszteséges térbeli felbontás), sebessége elméletileg elérheti a 2000 fps-t (a gyakorlatban gyakran más tényezők korlátozzák).
Ha aggódik a fényfehérítés vagy a nagyon gyenge fluoreszcens jel miatt, akkor az SDCM megfelelőbb lehet. Az SDCM két forgó korongot használ elrendezett mikroüregekkel a gerjesztő fény eloszlatására. Ellentétben az LSCM-mel, amely a mintafoltot szkenneli, az SDCM egyszerre több foltot (körülbelül 100 pixeles foltot) szerez, így a sebesség jelentősen megnő, az SDCM fényfehéredése és a fototoxicitás csökken. Használhat azonban gyors pásztázó konfokális eszközöket is a pásztázási sebesség növelésére, kombinálva a rendkívül érzékeny detektorokkal, és csökkentheti a gerjesztő fényenergiát a fototoxicitás csökkentése érdekében, ami megőrzi a hagyományos konfokálisok gazdag funkcióit.
Automatizált konfokális képalkotó rendszer
Egyes kutatók szeretnek módot találni arra, hogy a mikroszkópot egyéni igényeiknek megfelelően módosítsák. Néhány kutatót pedig nem is érdekel a mikroszkópok tényleges működése. Utóbbiak számára inkább egy automata konfokális mikroszkóp lehet a kedvükre való. Például az Olympus FluoViewFV10i egy teljesen automatikus asztali 4-lézeres konfokális mikroszkóp. Kompakt, integrált szerkezete szinte nem igényel beépítési helyet. Ez a fajta műszer ideális azoknak a kutatóknak, akiknek naponta sok képi adatgyűjtést kell végezniük, de természetesen nem tükrözik teljes mértékben a hagyományos konfokálisok funkcionalitását és rugalmasságát. Ezenkívül a NikonA1 egy teljesen automatikus konfokális rendszer is. A legtöbb hagyományos konfokális pásztázó mikroszkóphoz hasonlóan a NikonA1 is galvanométeres leolvasófejet használ, amely nagyobb felbontású, mint a hibrid leolvasófejjel rendelkező A1R, de valamivel lassabb a sebessége (A1R ~30 fps).
