Különbségek a fluoreszcens mikroszkópok és a hagyományos fénymikroszkópok között
A fluoreszcens mikroszkópok különböznek a hagyományos optikai mikroszkópoktól. Ahelyett, hogy a mintákat közönséges fényforrásból származó fénnyel figyelnék meg, meghatározott hullámhosszúságú fényt (általában ultraibolya vagy kékeslila fényt) használnak a mikroszkóp tárgylemezén lévő mintán belüli fluoreszcens anyagok gerjesztésére, és ezek az anyagok fluoreszcenciát bocsátanak ki. Ezért a fluoreszcens mikroszkóp fényforrása nem világítja meg közvetlenül a mintát; energiaforrásként gerjeszti a mintában lévő endogén fluoreszcens anyagokat. A mintát nem magából a fényforrásból származó megvilágítás miatt láthatjuk, hanem azért, mert a mintában lévő fluoreszcens anyagok elnyelik a gerjesztő fényenergiát, majd fluoreszcenciát bocsátanak ki.
Ebből következik, hogy a fluoreszcens mikroszkóp legfontosabb jellemzője, hogy fényforrása adott hullámhosszúságú gerjesztő fényt képes szolgáltatni, lehetővé téve, hogy a vizsgált mintában lévő fluoreszcens anyagok megfelelő intenzitású fluoreszcenciát bocsássanak ki. Eközben a fluoreszcens mikroszkópot fel kell szerelni a megfelelő szűrőrendszerrel. A fluoreszcens hisztokémia elengedhetetlen eszköze. A fluoreszcens mikroszkóp főként egy ultra-nagy nyomású fényforrásból, egy szűrőrendszerből (beleértve a gerjesztőszűrőket és a gátszűrőket), egy optikai rendszerből és egy fényképészeti rendszerből áll. Úgy működik, hogy meghatározott hullámhosszú fényt használ a fluoreszcens anyagok gerjesztésére.
① A fluoreszcencia gerjesztés módszerei A gerjesztő fény hullámhossz-tartományától függően két típus létezik: UV gerjesztési módszer (ultraibolya megvilágítási módszer) és BV gerjesztési módszer (kék-ibolya megvilágítási módszer). Az UV gerjesztési módszer 400 nm-nél rövidebb ultraibolya fényt használ. Láthatatlan fluoreszcenciát generál, így a megfigyelt fluoreszcencia magából a mintából származik. Ez a módszer könnyen megkülönbözteti a specifikus fluoreszcenciát a háttér autofluoreszcenciájától.
② BV gerjesztési módszer A BV gerjesztési módszer ibolyától kékig terjedő gerjesztő fényt használ, 404 nm és 434 nm-en. Mivel kék fényt használnak a minta besugárzására, az ennél a módszernél alkalmazott gerjesztőszűrő rendszernek teljesen el kell zárnia a kék fényt, és csak a szükséges zöld és sárga fényt kell átengednie. Fluoreszcens antitestfestés esetén a gerjesztő fény maximális abszorpciós hullámhossza közel van a fluoreszcens festék maximális emissziós hullámhosszához. Emiatt a BV gerjesztéshez használt szűrőkészletben levágási zárószűrőt kell használni. Ez a módszer kék fényt használ a gerjesztéshez, így a fluoreszcencia gyűjtési hatékonysága viszonylag magas, és világosabb képeket kaphatunk. Hátránya, hogy 500 nm feletti fluoreszcencia nem mutatható ki, 500 nm felett pedig csak sárgászöld képek láthatók. A fluoreszcens antitestfestésben a specificitás megítélése nagymértékben függ a színinformációktól, így a BV gerjesztési módszer hátránya jelentős korlát lehet a finom specificitás megvitatása során.
