A mikroorganizmusok számának meghatározása - a mikroszkóp közvetlen számláló módszere!
A baktériumpopuláció növekedése a sejtszám növekedésében vagy a sejttömeg növekedésében nyilvánul meg. A sejtek számának meghatározására szolgáló módszerek közé tartozik a közvetlen mikroszkópos számlálási módszer, a lemezkolóniaszámlálási módszer, a fotoelektromos olajarány módszer, a maximális valószínűségi módszer és a membránszűrési módszer. A sejtanyag mérési módszerei közé tartozik a sejtek száraz tömegének meghatározása, bizonyos sejtösszetevők, például nitrogén-, RNS- és DNS-tartalom meghatározása, valamint a metabolitok meghatározása. Röviden, számos módszer létezik a mikroorganizmusok szaporodásának mérésére, mindegyiknek megvannak a maga előnyei és hátrányai, és ezeket az adott helyzetnek megfelelően kell kiválasztani. Ez a kísérlet elsősorban a termelésben és a tudományos kutatásban általánosan használt mikroszkópos közvetlen számlálási módszert mutatja be.
1. Célra vonatkozó követelmények
1. Tisztázza a vérsejtszám elvét!
2. Sajátítsa el a mikroorganizmusok vérsejtszámláló segítségével történő megszámlálásának módszerét.
2. Alapelvek
A mikroszkópos közvetlen számlálási módszer egy egyszerű, gyors és intuitív módszer a vizsgálandó minta kis mennyiségű szuszpenziójának közvetlen megszámlálására egy speciális, meghatározott területű és térfogatú üveglemezen (más néven baktériumszámláló). Mód. Jelenleg itthon és külföldön a leggyakrabban használt baktériumszámlálók: vérsejtszámláló tábla, Peteroff-Hauser baktériumszámláló és Hawksley baktériumszámláló stb. használhatók élesztőgombák, baktériumok, penészgombák és egyéb szuszpenziók számlálására, ill. az alapelv ugyanaz. Az utóbbi két típusú baktériumszámláló teljes térfogata 0.02mm3 fedőüveggel letakarva, a fedőüveg és a tárgylemez távolsága pedig mindössze 0,02 mm, tehát az olaj immerziós objektívvel kis sejtek, például baktériumok megfigyelésére és megfigyelésére használható. számol. Ezeken a bakteriométereken kívül létezik egy becslési módszer is a kenet területének és a mikroszkóp alatt közvetlenül megfigyelt látómező területéhez viszonyítva, amelyet általában a tej bakteriológiai vizsgálatára használnak. A mikroszkópos közvetlen számlálási módszer előnyei intuitívak, gyorsak és könnyen kezelhetők. A módszer hátránya azonban, hogy a mért eredmény általában az elhalt és az élő sejtek összege. Jelenleg létezik néhány módszer ennek a hiányosságnak a kiküszöbölésére, például az életképes baktériumok mikrokamrás tenyészetet festő kombinációjával (rövid ideig) és sejtosztódást gátló szerek hozzáadásával, hogy elérjék azt a célt, hogy csak az életképes baktériumokat számolják.
Ebben a kísérletben egy hemocitométert használtunk példaként a közvetlen mikroszkópos számláláshoz. A másik két típusú baktériumszámláló használatához olvassa el az egyes gyártók utasításait. A közvetlenül a mikroszkóp alatt végzett számlálás hemocitométerrel a mikroorganizmusok megszámlálásának általánosan használt módszere. A számlálólap egy speciális üvegcsúszda, amelyen négy rés három platformot alkot; a középső szélesebb platformot egy rövid keresztirányú rés két felére osztja, és az emelvény mindkét oldalán rács található. Minden rács kilenc nagy négyzetre van osztva, és a középső nagy négyzet a számláló szoba. A vérsejtszámláló lemez szerkezetét az l{{{{10}}}} ábra mutatja. A számlálószoba léptékének általában két specifikációja van: az egyik egy nagy négyzet, amely 25 középső négyzetre van osztva, és minden középső négyzet 16 kis négyzetre van osztva (15-2 ábra); a másik egy nagy négyzet. A négyzet 16 középső négyzetre van osztva, és minden középső négyzet 25 kis négyzetre van osztva, de nem számít, milyen számlálótábláról van szó, minden nagy négyzetben 400 kis négyzet található. Minden nagy négyzet oldalhossza 1 mm, és minden nagy négyzet területe 1 mm2. Takaróüveggel való letakarás után a fedőüveg és a csúszóüveg közötti magasság 0,1mm, így a számlálókamra térfogata 0,lmm3 (egy ezred milliliter). Ábra 15-1 A vérsejtszámláló tábla felépítése (1) Ábra 15-2 A vérsejtszámláló tábla felépítése (2) A. Elölnézet; B. Hosszanti metszet; A kibővített rács, a középen lévő nagy négyzet a számláló kamra 1. Vérsejtek Számláló lemez; 2. Takaróüveg; 3. Amikor a számlálókamrában számol, általában öt négyzetben számolja meg a baktériumok teljes számát, majd számítsa ki az egyes négyzetek átlagát, és szorozza meg 25-tel vagy 16-tal, hogy megkapja. A nagy négyzetben lévő baktériumok teljes számát ezután a a baktériumok teljes száma 1 ml bakteriális oldatban. Legyen az öt négyzetben lévő baktériumok teljes száma A, a baktériumoldat hígítási aránya pedig B. Ha ez egy 25 négyzetes számlálólemez, akkor a baktériumok teljes száma 1 ml baktériumoldatban {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(darab) Hasonlóképpen, ha 16 közepes négyzetből álló számlálólemezről van szó, a baktériumok teljes száma 1 ml baktériumoldatban=A/ 5×16×104×B=32000A·B (darab)
3. Berendezés
1. Baktériumok
Saccharomyces cerevisiae
2. Eszközök vagy egyéb eszközök
Hemocitométer, mikroszkóp, fedőlemez, steril kapilláris cseppentő.
4. A művelet lépései
1. Baktériumszuszpenzió készítése
A Saccharomyces cerevisiae-ből megfelelő koncentrációjú baktériumszuszpenziót készítettünk steril fiziológiás sóoldattal.
2. Mikroszkóp számláló szoba
A minták hozzáadása előtt mikroszkóppal vizsgálja meg a számlálólemez számlálókamráját. Ha szennyeződés van, számolás előtt meg kell tisztítani és meg kell szárítani.
3. Adjon hozzá mintát
A tiszta és száraz hemocitométert fedjük le fedőlemezzel, majd steril kapilláris cseppentővel csepegtessünk le egy kis cseppet a felrázott Saccharomyces cerevisiae szuszpenzióból a fedőlemez széléről, és hagyjuk, hogy a baktériumoldat a rés mentén kapilláris ozmózissal automatikusan mozogjon. A számlálószobába belépve az általános számlálóhelyiség megtölthető bakteriális folyadékkal. Mintavételkor először rázza fel a baktériumoldatot; a minták hozzáadásakor a számlálókamrában nem keletkezhetnek légbuborékok.
4. Mikroszkópos számlálás
A minta hozzáadása után álljon 5 percig, majd helyezze a hemocitométert a mikroszkóp tárgyasztalára, először kis teljesítményű mikroszkóppal keresse meg a számlálókamra helyét, majd kapcsoljon át nagy teljesítményű mikroszkópra a számláláshoz. Állítsa be megfelelően a mikroszkóp fényének erősségét. A világításra tükröt használó mikroszkópoknál ügyeljen arra, hogy ne térjen el a fény egyik oldaláról, különben nem lesz könnyű a látómezőben tisztán látni a számlálószoba négyzetes vonalait, vagy csak a függőleges vagy vízszintes vonalak láthatók legyenek. Ha azt találjuk, hogy a baktériumoldat túl tömény vagy túl híg a számlálás előtt, a hígítást a számlálás előtt újra be kell állítani. Általában a mintahígításhoz körülbelül 5-10 baktérium szükséges minden kis sejtben. Minden számlálókamra 5 középső cellát választ ki (opcionális 4 sarok és egy középső cella a közepén) a számláláshoz. A rácsvonalon található cellák általában csak a felső és a jobb oldali sorban vannak számolva. Élesztő bimbózás esetén, amikor a bimbó mérete eléri az anyasejt felét, két baktériumsejtnek számít. A minta megszámlálásához számítsa ki a minta baktériumtartalmát a két számlálókamra átlagértékének kiszámításával.
5. Mossa meg a vérsejtszámot
Használat után öblítse le a vérsejtszámláló táblát vízzel a csapban, ne súrolja kemény tárggyal, és mosás után szárítsa meg egyedül vagy hajszárítóval. Mikroszkópos vizsgálat annak megfigyelésére, hogy vannak-e maradék baktériumok vagy egyéb üledékek az egyes kis sejtekben. Ha nem tiszta, többször meg kell mosni, amíg tiszta nem lesz.
