A konfokális mikroszkóp és a közönséges optikai mikroszkóp összehasonlítása
Általános optikai mikroszkóp
Az általános biológiai mikroszkóp három részből áll, nevezetesen: ① megvilágító rendszer, beleértve a fényforrást és a kondenzátort; ② Az optikai erősítő rendszer, amely objektívlencséből és okulárból áll, a mikroszkóp fő része. A szférikus aberráció és a kromatikus aberráció kiküszöbölése érdekében mind a szemlencse, mind az objektívlencse összetett lencsecsoportokból áll; (3) mechanikus eszköz, amelyet anyagok rögzítésére és kényelmes megfigyelésre használnak.
Az, hogy a mikroszkóp képe tiszta vagy sem, nem csak a nagyítástól függ, hanem a mikroszkóp felbontásától is. A felbontás a mikroszkóp (vagy annak a helynek, ahol az emberi szem 25 cm-re van a célponttól) azon képességére utal, hogy meg tudja különböztetni a tárgy zui kis távolságát. A felbontás függ a fény hullámhosszától, a rekesznyílás arányától és a közeg törésmutatójától, amelyet a következő képlettel fejezünk ki:
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsin /2
Ahol: n= a közeg törésmutatója;=tükörszög (a minta nyitási szöge az objektív rekesznyílásához képest), és NA= numerikus rekesznyílás. A tükörszög mindig kisebb, mint 180? Ezért a sina/2 zui értékének 1-nél kisebbnek kell lennie.
Az optikai lencsék készítéséhez használt üveg törésmutatója 1,65-1,78, és a felhasznált közeg törésmutatója közelebb van az üvegéhez, annál jobb. Száraz objektív esetén a közeg levegő, és a rekesznyílás aránya általában 0.05 ~ 0,95; Az olajlencse illatos aszfaltot használ közegként, és a lencse nyitási aránya közel 1,5 lehet.
A közönséges fény hullámhossza 400~700 nm, tehát a mikroszkóp felbontása nem kevesebb 0,2 μm-nél, az emberi szem felbontása pedig 0,2 mm, tehát a zui nagy nagyítása az általános mikroszkóp általában 1000X x.
Miért van szüksége konfokális mikroszkópra?
1. Az optikai mikroszkóp tökéletesebbé vált nagy elődeink erőfeszítései és fejlesztései révén. Valójában a közönséges mikroszkópok egyszerűen és gyorsan gyönyörű mikroszkopikus képeket biztosítanak számunkra. Történt azonban egy esemény, amely forradalmi újítást hozott ebbe a szinte tökéletes mikroszkópvilágba, amely a "lézer pásztázó konfokális mikroszkóp" találmánya. Ennek az új mikroszkópnak az a jellemzője, hogy olyan optikai rendszert alkalmaz, amely csak azon a síkon nyeri ki a képinformációkat, ahol a fókusz koncentrálódik, és a kapott információt visszaállítja a képmemóriában, miközben a fókuszt változtatja, így élénk képet kap teljes háromdimenziós információval. megszerezhető. Ezzel a módszerrel egyszerűen megszerezhető olyan információ a felület alakjáról, amelyet közönséges mikroszkóppal nem lehet megerősíteni. Ráadásul a közönséges optikai mikroszkópoknál a "felbontás javítása" és a "fókuszmélység elmélyítése" ellentmondásos feltételek, különösen nagy nagyításnál, de a konfokális mikroszkópoknál ez a probléma megoldódik.
2. A konfokális optikai rendszer előnyei
Konfokális optikai rendszer világítja meg a mintavételi pontot, és a visszavert fényt is pontreceptorok fogadják. Ha a mintát fókuszhelyzetbe helyezzük, akkor szinte az összes visszavert fény elérheti a fotoreceptort, de ha a minta eltér a fókusztól, a visszavert fény nem éri el a fotoreceptort. Vagyis a konfokális optikai rendszerben csak a fókusszal egybeeső kép kerül kibocsátásra, a fakula és a haszontalan szórt fény pedig árnyékolásra kerül.
3. Miért érdemes lézert használni?
A konfokális optikai rendszerben a mintát megvilágítják és a visszavert fényt egy pontszerű fotoreceptor is fogadja. Ezért pontszerű fényforrás szükséges. A lézer nagyon pontszerű fényforráshoz tartozik. A legtöbb esetben a konfokális mikroszkóp fényforrása lézeres fényforrást alkalmaz. Emellett a lézer olyan jellemzői, mint a monokromatikusság, az irányíthatóság és a kiváló sugárforma szintén fontos okai a széles körű használatának.
4. Lehetővé válik a nagysebességű szkennelésen alapuló valós idejű megfigyelés.
A lézeres szkennelésnél az Acoustic Optical Deflector (AO prime elem) vízszintes, a Servo Galvano-tükör pedig függőleges irányban kerül felhasználásra. Mivel az akusztikus optikai eltérítő egységben nincs mechanikus vibrációs alkatrész, nagy sebességgel képes pásztázni, és valós időben lehet megfigyelni a felügyeleti képernyőn. A fényképezőgép nagy sebessége nagyon fontos projekt, amely közvetlenül befolyásolja a fókuszálás és a pozíciókeresés sebességét.
5. A fókusz helyzete és a fényerő kapcsolata
A konfokális optikai rendszerben, ha a mintát helyesen helyezzük el a fókuszhelyzetben, a fényerő nagy, előtte és utána pedig erősen csökken a fényerő (folytonos vonal a 4. ábrán). A fókuszsík érzékeny szelektivitása egyben a konfokális mikroszkóp magassági irányának mérésének és a fókuszmélység növelésének elve is. Ezzel szemben a közönséges optikai mikroszkópban nincs nyilvánvaló fényességváltozás a fókuszpozíció előtt és után (szaggatott vonal a 4. ábrán).
6. Nagy kontraszt és nagy felbontás
Az általános optikai mikroszkópban a fókusztól eltérõ visszavert fény interferál, és átfedi a fókusz képalkotó részt, így csökken a kép kontrasztja. Ezzel szemben a konfokális optikai rendszerben a fókuszon kívüli szórt fényt és az objektívlencsén belüli szórt fényt szinte teljesen eltávolítják, így nagyon nagy kontrasztú képet kaphatunk. Ráadásul, mivel a fény kétszer halad át az objektívlencsén, először a pontkép élesedik, és a mikroszkóp felbontása is javul.
7. Optikai lokalizációs funkció
A konfokális optikai rendszerben a fókuszponttól eltérő rész visszavert fényét mikropórusok árnyékolják. Ezért egy háromdimenziós minta megfigyelésekor olyan kép jön létre, mint amilyen a minta fókuszálása után keletkezik (5. ábra). Ezt a hatást optikai lokalizációnak nevezzük, amely a konfokális optikai rendszerek egyik specialitása.
8. Fókusz mozgó memória funkció
A fókuszon kívüli, úgynevezett visszavert fényt a mikropórusok árnyékolják. Másrészt úgy tekinthetjük, hogy a konfokális optikai rendszer által alkotott képen minden pont egybeesik a fókusszal. Ezért, ha a háromdimenziós mintát a Z tengely (optikai tengely) irányában mozgatjuk, a kép felhalmozódik és a memóriában tárolódik, és a zui végül megkapja azt a képet, amely a teljes minta és a fókusz egybeesésével keletkezik. . Ily módon a végtelen mélységélesség függvényét mobil memória funkciónak nevezzük.
9. Felületi forma mérési funkció
A fókuszmozgató funkcióban egy magasságrögzítő hurok hozzáadásával érintésmentesen mérhető a minta felületi formája. Ezen funkció alapján lehetőség nyílik az egyes pixelekben a zui nagy fényességértéke által képzett Z-tengely koordináták rögzítésére, és ezen információk alapján a minta felületi alakjára vonatkozó információk nyerhetők.
10. Nagy pontosságú mikroméretű mérési funkció
A fényvevő egység egydimenziós CCD képalkotó érzékelőt alkalmaz, így nem befolyásolhatja a letapogató eszköz szkennelési dőlése, így nagy pontosságú mérés végezhető. Ezen túlmenően, mivel a fókuszmozgató memória funkció állítható fókuszmélységgel egyidejűleg kerül alkalmazásra, a fókuszeltolás okozta mérési hiba kiküszöbölhető.
11. Háromdimenziós képelemzés
A felületalak mérő funkció segítségével könnyen elkészíthető a mintafelület háromdimenziós képe. Nem csak ez, hanem sokféle elemzés is elvégezhető, mint például: felületi érdesség mérés, terület, térfogat, felület, körkörösség, sugár, zui hossza, kerület, súlypont, tomográfiai kép, FFT transzformáció, vonal szélességmérés és így tovább.
A lézeres konfokális pásztázó mikroszkóp nem csak a sejtmorfológia megfigyelésére, hanem a sejtek biokémiai komponenseinek kvantitatív elemzésére, optikai sűrűségstatisztikára és sejtmorfológiai mérésre is használható.
