A fluoreszcens mikroszkóp és a közönséges fénymikroszkóp összehasonlítása és jellemzői
A fluoreszcens mikroszkópok különböznek a hagyományos fénymikroszkópoktól. Ahelyett, hogy hagyományos fényforrással megvilágított mintákat figyelnének meg, meghatározott hullámhosszú fényt (általában ultraibolya vagy kék-lila fényt) használnak a mintában lévő fluoreszcens anyagok gerjesztésére a mikroszkópon, ami fluoreszcenciát bocsát ki. Ezért a fluoreszcens mikroszkóp fényforrása nem szolgál közvetlen megvilágításra; energiaforrásként működik a mintában lévő endogén fluoreszcens anyagok gerjesztésére. A próbatestet nem a fényforrás megvilágítása miatt tudjuk megfigyelni, hanem a fluoreszcens jelenség miatt, amely azután jön létre, hogy a mintában lévő fluoreszcens anyagok elnyelik a gerjesztő fényenergiát.
Ebből következik, hogy a fluoreszcens mikroszkóp legfontosabb jellemzője, hogy fényforrása bőséges gerjesztő fényt bocsát ki meghatározott hullámhossz-tartományon belül, így a próbatestben lévő fluoreszcens anyagok megfelelő intenzitású gerjesztő fényt kaphatnak. Eközben a fluoreszcens mikroszkópot megfelelő szűrőrendszerrel kell felszerelni. A fluoreszcens mikroszkóp a fluoreszcencia hisztokémia alapvető eszköze. Fő összetevőkből áll, beleértve az ultranagy nyomású fényforrást, egy szűrőkészletet (beleértve a gerjesztő és gátszűrőket), egy optikai rendszert és egy fényképészeti rendszert. Úgy működik, hogy a mintákat bizonyos hullámhosszú fénnyel gerjeszti, hogy fluoreszcens emissziót váltson ki.
Fluoreszcens gerjesztési módszerek: Hullámhossz-tartomány szerint két típusba sorolhatók: UV-gerjesztés (ultraibolya megvilágításos módszer) és BV-gerjesztés (kék-ibolya fény módszer). Az UV gerjesztési módszer 400 nm-nél rövidebb közeli ultraibolya fényt használ a gerjesztéshez. Ezzel a módszerrel nincs látható gerjesztő fény. Következésképpen a megfigyelt fluoreszcencia a festékben rejlő fluoreszcenciát mutatja, ami megkönnyíti a minta specifikus fluoreszcenciájának megkülönböztetését a háttérszövet autofluoreszcenciájától.
BV gerjesztési módszer: A gerjesztést ultraibolya sugárzástól kékig terjedő fénnyel hajtjuk végre, 404 nm és 434 nm középpontjával. Mivel ez a módszer kék fénnyel sugározza be a mintát, a fluoreszcencia megfigyelő rendszer szűrőjének teljes mértékben el kell zárnia a kék fényt, miközben kellően továbbítja a szükséges zöld és sárga fluoreszcenciát. A fluoreszcens antitest-vizsgálatokban használt fluorokrómokra alkalmazzák. A gerjesztő fény maximális abszorpciós hullámhossza viszonylag közel van a fluoreszcencia maximális emissziós hullámhosszához, ezért a BV gerjesztési módszernél az éles vágású szűrők használata kötelező. Ebben a megközelítésben a kék fény használható gerjesztő fényként, amely a fluorokrómok magas elnyelési hatékonyságát és viszonylag világos képeket eredményez. Hátránya, hogy az 500 nm alatti fluoreszcencia nem észlelhető, míg az 500 nm feletti jelek a teljes képet sárgává teszik. A fluoreszcens antitest vizsgálatok során a specificitást leginkább a fluorokrómok jellegzetes színe alapján ítélik meg. Ezért, amikor a finom specifitás értékelés alatt áll, a BV gerjesztési módszer hátrányai gyakran jelentős káros hatást fejtenek ki.
