A konfokális fluoreszcens mikroszkópia gyakorlati ismerete
A konfokális fluoreszcens mikroszkópia alapelve: Használjon pontszerű fényforrást a minta megvilágításához, hogy a fókuszsíkon egy kis, jól körülhatárolható fényfoltot képezzen. A megvilágítás után a folt által kibocsátott fluoreszcenciát az objektívlencse összegyűjti, és az eredeti megvilágítási fénypálya mentén visszajuttatja a dikroikus tükörbe. sugárosztót alkotnak. A spektrométer a fluoreszcenciát közvetlenül a detektorba küldi. A fényforrás és a detektor előtt van egy tűlyuk, amelyeket megvilágítási tűlyuknak, illetve érzékelő tűlyuknak neveznek. A kettő geometriai méretei konzisztensek, körülbelül 100-200nm; a fókuszsíkon lévő fényponthoz képest a kettő konjugált, vagyis a fénypont egy sor lencsén halad át, és végül egyszerre fókuszálható a megvilágítási tűlyukra és az érzékelési tűlyukra. Ily módon a fókuszsíkból érkező fény az érzékelési lyukon belül koncentrálható, míg a fókuszsík felett vagy alatt szórt fény az érzékelési lyukon kívül blokkolva van, és nem leképezhető. A mintát pontról pontra pásztázza a lézerrel, és az érzékelési tűlyuk mögötti fénysokszorozó cső pontról pontra megkapja a megfelelő fény konfokális képét is, amelyet digitális jellé alakítva továbbít a számítógépnek, végül aggregálódik a képernyőt a teljes fókuszsík tiszta konfokális képévé. .
Minden egyes fókuszsík kép valójában a minta optikai keresztmetszete. Ennek az optikai keresztmetszetnek mindig van egy bizonyos vastagsága, és optikai vékony metszetnek is nevezik. Mivel a fókuszban lévő fény intenzitása sokkal nagyobb, mint a nem fókuszban lévő fény intenzitása, és a nem fókuszsík fényét a tűlyuk szűri, a konfokális rendszer mélységélessége megközelítőleg nulla. A Z-tengely irányú pásztázása optikai tomográfiát valósíthat meg, kialakítva a kívánt. Figyelje meg a kétdimenziós optikai metszetet a minta fókuszált pontján. Az XY sík (fókuszsík) szkennelés Z tengelyes (optikai tengely) szkenneléssel kombinálásával, a kétdimenziós képek folyamatos szintjei felhalmozásával és speciális számítógépes szoftverrel történő feldolgozásával a mintáról háromdimenziós képe nyerhető.
Vagyis az érzékelési tűlyuk és a fényforrás tűlyuk mindig ugyanarra a pontra fókuszálnak, így a fókuszsíkon kívül gerjesztett fluoreszcencia nem juthat be az érzékelési tűlyukba.
A lézeres konfokális működési elvének egyszerű kifejezése az, hogy lézert használ fényforrásként. A hagyományos fluoreszcens mikroszkópos képalkotás alapján egy lézeres pásztázó berendezést és egy konjugált fókuszáló berendezést egészítenek ki, a rendszert pedig számítógép vezérli a digitális képek összegyűjtésére és feldolgozására.
