Különböző szuperfelbontású mikroszkópiás technikák összehasonlítása
A hagyományos fénymikroszkópiánál a fény diffrakciója körülbelül 250 nm-re korlátozza a képfelbontást. Ma a szuperfelbontású technikák ezt több mint 10-szeresére javíthatják. Ezt a technikát főként három módszerrel érik el: egymolekulás lokalizációs mikroszkóppal, beleértve a fényérzékeny lokalizációs mikroszkópot (PALM) és a sztochasztikus optikai rekonstrukciós mikroszkópot (STORM); strukturált megvilágítású mikroszkóp (SIM); és stimulált emissziós kimerülési mikroszkópia (STED). Mindenkit érdekel a szuperfelbontású technológia kiválasztása. "Sajnos nincsenek egyszerű alapelvek annak eldöntésére, hogy melyik módszert alkalmazzuk" - mondja Mathew Stracy, az Egyesült Királyság Oxfordi Egyetemének posztdoktori kutatója. – Mindegyiknek megvannak a maga előnyei és hátrányai. A tudósok természetesen azt is kitalálják, hogyan válasszák ki a megfelelő módszert egy adott projekthez. "A bioképalkotással összefüggésben a legfontosabb figyelembe veendő tényezők a következők: térbeli és időbeli felbontás, fénykárosodásra való érzékenység, jelölési kapacitás, mintavastagság és háttérfluoreszcencia vagy sejtautológ fluoreszcencia." Hogyan működik A különféle szuperfelbontású mikroszkópok különböző módon működnek. A PALM és a STORM esetében a fluoreszcens markereknek csak egy kis része gerjesztődik vagy fotoaktiválódik egy adott pillanatban, ami lehetővé teszi azok független lokalizálását, nagy pontossággal. Ezen a folyamaton az összes fluoreszkáló címkével végighaladva teljes szuperfelbontású képet kapunk. Stefan Hell, a 2014-es kémiai Nobel-díj egyik kitüntetettje és a Max Planck Biofizikai Kémiai Intézet igazgatója elmondta: "A PALM/STORM rendszert viszonylag könnyű felállítani, de nehéz alkalmazni, mert a fluoreszcens A csoportnak fotoaktivációs képességgel kell rendelkeznie. Korlátok A hátrány az, hogy egyetlen fluoreszcens molekulát kell kimutatniuk egy sejt kontextusában, és kevésbé megbízhatóak, mint a STED." A STED lézerimpulzust használ a fluorofor gerjesztésére és egy gyűrű alakú lézert a fluorofor kioltására, így csak a közepes nanométer méretű fluoreszcencia marad meg a szuperfelbontáshoz. A teljes minta szkennelésével kép jön létre. "A STED előnye, hogy nyomógombos technológia" - magyarázta Hell. "Úgy működik, mint egy szabványos konfokális fluoreszcens mikroszkóp." Élő sejteket is képes leképezni fluoroforok, például zöld vagy sárga fluoreszcens fehérjék és rodamin eredetű festékek felhasználásával. Paraméterek összehasonlítása Bár minden szuperfelbontású technika a felbontás tekintetében felülmúlja a hagyományos fénymikroszkópiát, mégis különböznek egymástól. A SIM nagyjából megduplázza a felbontást, körülbelül 100 nm-re. A PALM és a STORM képes feloldani a 15 nm-es célpontokat. A Hell szerint a STED 30 nm-es térbeli felbontást biztosít élő sejtekben és 15 nm-es fix sejtekben. Amikor konkrét alkalmazásokról van szó, a jel-zaj arányt is figyelembe kell vennünk. Bizonyos esetekben alacsonyabb felbontás, de magasabb SNR jobb képet eredményezhet, mint az ellenkezője (nagyobb felbontás, de alacsonyabb SNR). A képfelvétel sebessége is nagyon fontos, különösen az élő sejtek esetében. "Minden szuperfelbontású technika lassabb, mint a hagyományos fluoreszcens képalkotási technikák" - mondta Stracy. "A PALM/STORM a leglassabb, több tízezer képkockára van szüksége egyetlen kép elkészítéséhez, a SIM-nek több tucat képkockára van szüksége, a STED pedig egy szkennelési technológia, így a felvételi sebesség a látómező méretétől függ." Az élő sejtek vagy a rögzített képalkotó sejtek mellett egyes tudósok azt is szeretnék megérteni, hogyan mozognak a tárgyak. Stracy érdekli az élő sejtekben lévő biológiai rendszerek dinamikájának megértése, nem csak a statikus képek. Az élő sejtek dinamikájának elemzéséhez a PALM-ot egyes részecskekövetéssel kombinálja. Ily módon közvetlenül nyomon tudja követni a markermolekulákat, amint azok ellátják funkcióikat. Úgy véli azonban, hogy a SIM nem alkalmas ezeknek a dinamikus folyamatoknak a molekuláris szintű vizsgálatára, hanem gyors felvételi sebessége miatt különösen alkalmas nagyobb struktúrák, például teljes kromoszómák dinamikájának megfigyelésére. A legfrissebb eredmények 2017-ben a Hell csapata beszámolt a MINFLUX szuperfelbontású mikroszkópról a Science-ben. Hell szerint ez a szuperfelbontású módszer először ér el 1 nm-es térbeli felbontást. Ezenkívül az élő sejtekben lévő egyes molekulákat legalább 100-szor gyorsabban képes követni, mint más módszerek. Más tudósok is elismerően nyilatkoztak a MINFLUX mikroszkópról. "Folyamatosan új alkalmazásokat és megközelítéseket fejlesztenek ki, de számomra két előrelépés tűnik ki" - mondta Shechtman. Az egyik a MINFLUX. "Zseniális megközelítést alkalmaz a nagyon pontos molekuláris pozicionálás érdekében." A második izgalmas fejlemény kapcsán Shechtman megemlítette WE Moernert és kollégáit a Stanford Egyetemen. Moerner 2014-ben a kémiai Nobel-díjat is megkapta. Az egyik nyertes. A fluoreszcens egyedi molekulák anizotróp szóródása által okozott képfelbontási korlátok kezelésére a tudósok különböző gerjesztési polarizációkat alkalmaztak a molekulák orientációjának és helyzetének meghatározására. Ezenkívül finom pupillafelületeket fejlesztettek ki. Ezek a technikák javítják a struktúrák lokalizálásának képességét. A fluoreszkáló címkékről Sok szuperfelbontású alkalmazásban a címkék igazán számítanak. Vannak olyan cégek is, amelyek kapcsolódó termékeket kínálnak. Például a német Miltenyi összeállt a Stefan Hell által alapított Abberior céggel, hogy egyedi antitest-konjugációs szolgáltatásokat nyújtson szuperfelbontású mikroszkópos festékekhez. Számos más cég is kínál megfelelő markereket. "Nano-Boostereink nagyon kicsik, mindössze 1,5 kDa-osak és nagyon specifikusak" - mondja Christoph Eckert, a ChromoTek marketing tisztje. Ezek a fehérjék kötődnek a zöld és vörös fluoreszcens fehérjékhez (GFP és RFP). VHH-ként vagy nanotestként ismert alpaka antitest-fragmensekből származnak, kiváló kötési tulajdonságokkal és stabil minőséggel, tételenkénti variáció nélkül. Ezek a markerek különféle szuperfelbontású technikákhoz alkalmasak, beleértve a SIM-et, a PALM-ot, a STORM-ot és a STED-et. Ai-Hui Tang, a Marylandi Egyetem Orvostudományi Karának adjunktusa és munkatársai a ChromoTek GFP-Booster és STORM segítségével vizsgálták az információ terjedését az idegrendszerben. Molekuláris nanoklasztereket, úgynevezett nanooszlopokat találtak a preszinaptikus és posztszinaptikus neuronokban. A tudósok úgy vélik, hogy ez a szerkezet azt mutatja, hogy a központi idegrendszer egyszerű elveket alkalmaz a szinaptikus hatékonyság fenntartására és szabályozására. A szuperfelbontású képalkotás különféle változatai és egyre több módszer még mélyebbre viszi a tudósokat a biológiai rejtélyekbe. A látható fény diffrakciós határának áttörésével a biológusok akár "szorosan figyelemmel kísérhetik" a sejtek működését.
