A fluoreszcens mikroszkóp elve és felépítése
A fluoreszcens mikroszkóp nagy fényhatékonyságú pontfényforrást használ, amely bizonyos hullámhosszú fényt (például ultraibolya fényt 3650 hüvelykben vagy ibolya kék fényt 4200 hüvelykben) bocsát ki gerjesztő fényként egy színszűrő rendszeren keresztül, és gerjeszti a mintában lévő fluoreszcens anyagokat különböző színű fluoreszcenciát bocsátanak ki. Ezt követően az objektív és a szemlencse nagyításával figyelhető meg. Ily módon még gyenge fluoreszcenciával is könnyen felismerhető és erős kontrasztos hátterek mellett nagyon érzékeny, elsősorban sejtszerkezet és funkció, valamint kémiai összetétel vizsgálatára használják. A fluoreszcens mikroszkóp alapszerkezete egy közönséges optikai mikroszkópból és néhány kiegészítőből áll (például fluoreszcens fényforrás, gerjesztő szűrő, bikromatikus nyalábleválasztó és blokkoló szűrő stb.). Fluoreszkáló fényforrások – általában ultranagy nyomású higanylámpákat (50-200W) használnak, amelyek különböző hullámhosszúságú fényt bocsátanak ki. Mindazonáltal minden fluoreszcens anyagnak van egy gerjesztési fény hullámhossza, amely a legerősebb fluoreszcenciát produkálja, ezért gerjesztő szűrőket (általában ultraibolya, lila, kék és zöld gerjesztő szűrőket) kell hozzáadni ahhoz, hogy csak egy bizonyos hullámhosszú gerjesztő fény tudjon áthaladni és megvilágítani. a mintát, miközben elnyeli az összes többi fényt. A gerjesztett fénnyel történő besugárzást követően minden anyag nagyon rövid időn belül a besugárzásnál hosszabb hullámhosszú látható fluoreszcenciát bocsát ki. A fluoreszcenciának van specifitása, és általában gyengébb, mint a gerjesztő fény. A specifikus fluoreszcencia megfigyeléséhez blokkoló (vagy elnyomó) szűrőt kell hozzáadni az objektívlencse mögé. Két funkciója van: egyrészt elnyeli és blokkolja a gerjesztő fényt a szemlencsébe, hogy elkerülje a fluoreszcenciát és a szem károsodását; másodszor, kiválasztja és átengedi a specifikus fluoreszcenciát, és egy meghatározott fluoreszcencia színt jelenít meg. Mindkét típusú szűrőt ki kell választani az együttes használathoz.
Az optikai útjuk alapján kétféle fluoreszcens mikroszkóp létezik:
1. Transzmissziós fluoreszcencia mikroszkóp: A gerjesztő fényforrást a minta anyagán egy kondenzátoron keresztül továbbítják a fluoreszcencia gerjesztésére. Az általánosan használt sötét mező fénykollektorok vagy közönséges fénykollektorok használhatók a reflektor beállítására, hogy a gerjesztő fényt és az oldalsó fényt a mintára alakítsák. Ez egy viszonylag régimódi fluoreszcens mikroszkóp. Előnye, hogy kis nagyításnál erős a fluoreszcencia, hátránya viszont, hogy a fluoreszcencia gyengül a nagyítás növekedésével. Ezért jobb nagyobb mintaanyagok megfigyelésére.
2. Zuhanósugaras fluoreszcens mikroszkóp Ez a modern időkben kifejlesztett új típusú fluoreszcens mikroszkóp. Az előzőtől eltérően a gerjesztő fény az objektív lencséjéről esik le a minta felületére, ugyanazt az objektívlencsét használva, mint a megvilágító kondenzátor és a fluoreszcencia gyűjtésére szolgáló objektív. Az optikai úthoz kettős színsugaras szeparátort kell hozzáadni, amely 45 fokos szöget zár be a könnyű uránnal. A gerjesztő fény visszaverődik az objektívlencsén, és a mintán koncentrálódik. A minta által generált fluoreszcencia, valamint az objektívlencse és a fedőüveg felületéről visszaverődő gerjesztő fény egyszerre jut be az objektívlencsékbe és tér vissza a dikroikus nyalábleválasztóba, elválasztva a gerjesztést és a fluoreszcenciát. A maradék gerjesztést ezután a blokkolószűrő elnyeli. Ha különböző gerjesztő szűrőket/kettős színsugaras szeparátorokat/blokkoló szűrőkombinációkat használnak, ezek kielégíthetik a különböző fluoreszcens reakciótermékek igényeit. Ennek a fluoreszcens mikroszkópnak az az előnye, hogy a látótér megvilágítása egyenletes, a képalkotás tiszta, és minél nagyobb a nagyítás, annál erősebb a fluoreszcencia.
