Mi az a kétfoton fluoreszcens mikroszkópia
A kétfotonos gerjesztés alapelve: nagy fotonsűrűség esetén a fluoreszcens molekulák egyszerre két hosszú hullámhosszú fotont tudnak elnyelni, és rövid, úgynevezett gerjesztett állapotú élettartam után egy rövidebb hullámhosszúságú fotont bocsátanak ki. . ; a hatás ugyanaz, mintha egy fluoreszcens molekula gerjesztésére olyan fotont használnánk, amelynek hullámhossza fele a hosszú hullámhossznak. A kétfotonos gerjesztéshez nagy fotonsűrűség szükséges. A sejtek károsodásának elkerülése érdekében a kétfotonos mikroszkópiában nagy energiájú üzemmódban zárt impulzuslézereket használnak. A lézer által kibocsátott lézer magas csúcsenergiával és alacsony átlagos energiával rendelkezik, impulzusszélessége mindössze 100 femtoszekundum, frekvenciája pedig elérheti a 80-100 megahertzet. Ha nagy numerikus apertúrájú objektívet használunk az impulzuslézer fotonjainak fókuszálására, az objektív gyújtópontjában a fotonsűrűség a legnagyobb, és a kétfotonos gerjesztés csak az objektív gyújtópontjában következik be, így a kétfoton mikroszkóphoz nincs szükség konfokális tűlyukra, ami javítja a fluoreszcencia detektálási hatékonyságot.
Az általános fluoreszcencia jelenségeknél a gerjesztő fény alacsony fotonsűrűsége miatt egy fluoreszcens molekula egyszerre csak egy fotont képes elnyelni, majd sugárzási átmeneten keresztül fluoreszcens fotont bocsát ki, ami egyfoton fluoreszcencia. A lézert fényforrásként használó fluoreszcens gerjesztési eljárásnál két- vagy akár többfoton fluoreszcencia is előfordulhat. Ekkor az alkalmazott gerjesztő fényforrás intenzitása nagy, a fotonsűrűség pedig megfelel a két fotont egyszerre elnyelő fluoreszcens molekulák követelményeinek. Az általános lézer gerjesztő fényforrásként történő alkalmazása során a fotonsűrűség még mindig nem elegendő a kétfoton abszorpciós jelenség kialakulásához. Általában femtoszekundumos impulzuslézert használnak, amelynek pillanatnyi teljesítménye elérheti a megawatt nagyságrendet. Ezért a kétfoton fluoreszcencia hullámhossza rövidebb, mint a gerjesztő fény hullámhossza, ami megegyezik a gerjesztési hullámhossz felénél jelentkező gerjesztéssel.
