A kétfoton fluoreszcens mikroszkópiának számos előnye van:
1) A hosszabb hullámhosszúságú fényt kevésbé befolyásolja a szórás, mint a rövidebb hullámhosszúságú fényeket, amelyek áthatolnak a mintán;
(2) A fókuszsíkon kívüli fluoreszcens molekulákat nem gerjesztik, így több gerjesztő fény érheti el a fókuszsíkot, így a gerjesztő fény mélyebbre hatolhat a mintába;
3) A hosszabb hullámhosszú közeli infravörös fény kevésbé mérgező a sejtekre, mint a rövidebb hullámhosszúak;
4) Ha kétfotonos mikroszkópot használunk a minta megfigyelésére, a fényfehérítés és a fototoxicitás csak a fókuszsíkon van jelen. Ezért a kétfotonos mikroszkópok alkalmasabbak az egyfotonos mikroszkópoknál vastag minták megfigyelésére, élő sejtek megfigyelésére vagy foltos fotofehérítési kísérletek elvégzésére.
Konfokális fluoreszcens mikroszkóp ismerete
A konfokális fluoreszcens mikroszkóp alapelve: pontszerű fényforrást használnak a minta besugárzására, kis, jól körülhatárolható fénypontot képezve a fókuszsíkon. A besugárzás után innen kibocsátott fluoreszcenciát az objektívlencse összegyűjti, és az eredeti besugárzási fényút mentén visszaküldi a kétirányú kromatikus tükörből álló sugárosztóba. A sugárosztó a fluoreszcenciát közvetlenül a detektorba küldi. Mind a fényforrás, mind a detektor előtt van egy lyuk, amelyet megvilágítási tűlyuknak, illetve érzékelő tűlyuknak neveznek. Mindkettőnek ugyanaz a geometriája, körülbelül 100-200 nm, és konjugáltak a fókuszsíkon lévő fényponthoz képest, azaz a fénypont egy sor lencsén halad át, és végül mindkét megvilágító felületre fókuszálható. és detektor tűlyukak. Ily módon a fókuszsíkból érkező fény a szonda apertúráján belül konvergálhat, míg a fókuszsík felett vagy alatt szórt fény blokkolva van a szonda nyílásán kívül, és nem lehet leképezni. A lézer pontról pontra pásztázza a mintát, és a fénysokszorozó cső a tűlyuk észlelése után pontról pontra megkapja a megfelelő fénypont konfokális képét is, amelyet digitális jellé alakítva továbbít a számítógépnek, végül pedig tiszta képpé konvergál. a teljes fókuszsík konfokális képe a képernyőn.
Minden egyes fókuszsík kép valójában a próbatest optikai keresztmetszete, és ennek az optikai keresztmetszetnek mindig van egy bizonyos vastagsága, más néven optikai lap. Mivel a fókuszpontban a fény intenzitása sokkal nagyobb, mint a nem fókuszpontban, és a nem fókuszsík fényét a tűlyuk szűri ki, a konfokális rendszer mélységélességét nullára közelítjük, és a pásztázás A Z-tengely iránya mentén lehetővé teszi az optikai tomográfiát, hogy a mintából kétdimenziós optikai szeletet képezzen, amely a fókuszponton megfigyelhető. Az XY sík (fókuszsík) szkennelés és a Z-tengely (optikai tengely) szkennelés kombinálásával kétdimenziós képek egymás utáni rétegeinek felhalmozásával háromdimenziós kép nyerhető a mintáról, amelyeket speciális számítógépes szoftver dolgoz fel.
Ez azt jelenti, hogy az érzékelési tűlyuk és a fényforrás tűlyuk mindig ugyanarra a pontra fókuszálnak, így a fókuszsíkon kívül gerjesztett fluoreszcencia nem juthat be az érzékelési tűlyukba.
A lézeres konfokális működési elve egyszerűen kifejezve, hogy lézert használ fényforrásként, hagyományos fluoreszcens mikroszkópos képalkotás, további lézeres leolvasó eszköz és konjugált fókuszáló eszköz alapján, számítógépes vezérléssel a digitális képgyűjtő és -feldolgozó rendszer végrehajtására.
