Kétféle fluoreszcens mikroszkóp létezik az optikai útjukat tekintve:
1. Transzmissziós fluoreszcencia mikroszkóp: A gerjesztő fényforrást a fluoreszcencia gerjesztésére használják úgy, hogy a mintaanyagon áthaladnak egy kondenzátorlencsén. Az általánosan használt sötétmezős koncentrátorok is használhatók, a hagyományos koncentrátorok pedig a reflektor beállítására használhatók, hogy a gerjesztő fényt a mintára irányítsák és oldalra tereljék. Ez egy viszonylag régi-módú fluoreszcens mikroszkóp. Előnye az erős fluoreszcencia kis nagyításnál, hátránya viszont, hogy a fluoreszcenciája a nagyítás növelésével csökken. Ezért jobb nagyobb mintaanyagok megfigyelésére.
2. A zuhanófényes fluoreszcens mikroszkóp a modern időkben kifejlesztett új típusú fluoreszcens mikroszkóp. A fentiektől eltérően a gerjesztő fény az objektívből lefelé esik a próbatest felületére, ugyanazt az objektívlencsét használva, mint a megvilágító kondenzátor és a fluoreszcencia gyűjtésére szolgáló objektív. Egy kétszínű sugárnyaláb osztót kell hozzáadni az optikai úthoz, amely 45 fokban van a könnyű urántól. Szög, a gerjesztő fény visszaverődik az objektív lencséjébe, és a mintára fókuszál. A minta által generált fluoreszcencia, valamint az objektívlencse és a fedőüveg felületéről visszaverődő gerjesztő fény az objektív lencséjébe jutva visszatér a kettős színsugár-osztóba, elválasztva a gerjesztő fényt és a fluoreszcenciát. A maradék gerjesztő fényt ezután elnyeli a blokkoló szűrő. Ha különböző gerjesztő szűrők/kettős színsugaras szeparátorok/blokkoló szűrők kombinációit használjuk, ezek kielégíthetik a különböző fluoreszcens reakciótermékek igényeit. Ennek a fluoreszcens mikroszkópnak az előnyei az egyenletes térmegvilágítás, a tiszta képalkotás és az erősebb fluoreszcencia nagyobb nagyítás mellett.
