Az optikai mikroszkóp fő megfigyelési módszere a fluoreszcens megfigyelés
A fluoreszcencia azt a folyamatot jelenti, amelyben egy fluoreszcens anyag adott hullámhosszú fénnyel besugározva csaknem egyidejűleg hosszabb hullámhosszú fényt bocsát ki (1. ábra). Amikor egy meghatározott hullámhosszú (gerjesztési hullámhosszúságú) fény becsap egy molekulába, például egy fluoroforba, a fotonenergiát a molekula elektronjai elnyelik. Ezután az elektronok az alapállapotból (S0) egy magasabb energiaszintre, a gerjesztett állapotba (S1') térnek át. Ezt a folyamatot gerjesztésnek ① nevezzük. Az elektron gerjesztett állapotban marad 10-9–10-8 másodpercig, ezalatt az elektron némi energiát veszít②. A gerjesztett állapotból (S1) kilépő elektronok alapállapotba ③ visszatérésének folyamata során a gerjesztési folyamat során elnyelt maradék energia felszabadul.
A fluoreszcens molekula tartózkodási ideje gerjesztett állapotban a fluoreszcens élettartam, amely általában nanoszekundumos szinten van, és magának a fluoreszcens molekulának a velejárója. A fluoreszcens élettartam képalkotást (FLIM), amely fluoreszcens élettartam képalkotási technológiát használ, fluoreszcens élettartam képalkotásnak (FLIM) nevezik. A fluoreszcencia intenzitású képalkotás mellett mélyebb funkcionális és pontosabb mérések is elérhetők a molekulák molekuláris konformációjának, intermolekuláris kölcsönhatásainak és mikrokörnyezetének meghatározásához. A hagyományos optikai képalkotással nehezen beszerezhető információk.
A fluoreszcencia másik fontos tulajdonsága a Stokes-eltolódás, a gerjesztési és emissziós csúcsok közötti hullámhossz-különbség (2. ábra). Általában az emissziós hullámhossz hosszabb, mint a gerjesztési hullámhossz. Ennek az az oka, hogy az elektronok elveszítik energiájuk egy részét a relaxációs folyamat során, miután a fluoreszcens anyagot gerjesztik, és mielőtt a fotonokat felszabadítanák. A nagyobb Stokes-eltolódású fluoreszcens anyagok könnyebben megfigyelhetők fluoreszcens mikroszkóp alatt.
Fluoreszcencia mikroszkóp és fluoreszcens szűrőkockák
A fluoreszcens mikroszkóp egy optikai mikroszkóp, amely fluoreszcens tulajdonságokat használ megfigyelésre és képalkotásra, és széles körben használják különféle területeken, például sejtbiológiában, neurobiológiában, botanikában, mikrobiológiában, patológiában és genetikában. A fluoreszcens képalkotás előnye a nagy érzékenység és nagy specificitás, és kiválóan alkalmas specifikus fehérjék és organellumok szövetekben és sejtekben való eloszlásának megfigyelésére, kolokalizáció és kölcsönhatás vizsgálatára, életdinamikus folyamatok, például ionkoncentráció változásainak követésére. stb.
A sejtekben a legtöbb molekula nem fluoreszkál, és ahhoz, hogy lássák őket, fluoreszcens jelöléssel kell rendelkezniük. Számos módszer létezik a fluoreszcens jelölésre, mint például a közvetlen jelölés (például DAPI használata a DNS jelölésére), vagy az immunfestés az antitestek antigénkötő tulajdonságait használva, vagy a fluoreszcens fehérjék (például GFP, zöld fluoreszcens fehérje) használata a célfehérjék jelölésére. , és megfordítható kötés. Szintetikus színezékek (például Fura-2) és így tovább.
A fluoreszcens mikroszkóp jelenleg a különböző laboratóriumok és képalkotó platformok szabványos képalkotó berendezése lett, és jó segítője mindennapi kísérleteinknek. A fluoreszcens mikroszkópok alapvetően három kategóriába sorolhatók: függőleges fluoreszcens mikroszkópok (szeletelésre alkalmasak), fordított fluoreszcens mikroszkópok (élő sejtekre alkalmasak, figyelembe véve a szeletelést), fluoreszcens sztereoszkópok (nagyobb példányok, például növények, zebrahal (felnőtt/embrió) vizsgálatára alkalmasak). ), medaka, egér/patkány szervek stb.).
A fluoreszcens szűrőblokk a mikroszkópos fluoreszcens képalkotás központi eleme. Három részből áll: gerjesztő szűrő, emissziós szűrő és dikroikus sugárosztó. A szűrőkerékbe van beépítve. Például a Leica DMi8 egy 6-pozíciószűrő kerékkel van felszerelve (3. ábra). A különböző mikroszkópkerekek pozícióinak száma eltérő lesz, és egyes mikroszkópok szűrőblokklemezeket használnak.
A szűrőblokk fontos szerepet játszik a fluoreszcens képalkotásban: a gerjesztő szűrő kiválasztja a gerjesztő fényt a minta gerjesztéséhez, és blokkolja a más hullámhosszúságú fényt; a gerjesztő szűrőn áthaladó fény áthalad a dikroikus tükörön (feladata a gerjesztő fény visszaverése és a fluoreszcencia átadása), visszaverődés után az objektív lencséje fókuszálja, besugározza a mintát, és gerjeszti a megfelelő fluoreszcenciát, azaz , kibocsátott fényt. A kibocsátott fényt az objektívlencse összegyűjti, áthalad a dikroikus sugárosztón, és eléri az emissziós szűrőt. A 4. ábrán látható: a gerjesztési hullámhossz 450-490 nm, a dikroikus tükör 510 nm-nél rövidebb fényt veri vissza, 510 nm-nél hosszabb fényt enged át, és a kibocsátott fény vételi tartománya 520-560 nm.
