Az optikai mikroszkóp fő megfigyelési módszere a fluoreszcens megfigyelés
Fluoreszcencia jelenség
A fluoreszcencia azt a folyamatot jelenti, amelyben egy fluoreszkáló anyag adott hullámhosszú fénnyel besugározva csaknem egyidejűleg hosszabb hullámhosszú fényt bocsát ki (1. ábra). Amikor egy meghatározott hullámhosszú (gerjesztési hullámhosszúságú) fény egy molekulába (például egy fluoroforban lévő molekulába) ütközik, a fotonenergiát a molekula elektronjai elnyelik. Ezután az elektronok az alapállapotból (S0) egy magasabb energiaszintre, a gerjesztett állapotba (S1') térnek át. Ezt a folyamatot gerjesztésnek ① nevezzük. Az elektron gerjesztett állapotban marad 10-9–10-8 másodpercig, ezalatt az elektron némi energiát veszít ②. A gerjesztett állapotból (S1) való kilépés és a ③ alapállapotba való visszatérés során a gerjesztési folyamat során elnyelt maradék energia felszabadul.
A fluoreszcens molekula tartózkodási ideje gerjesztett állapotban a fluoreszcens élettartam, általában nanoszekundumban, ami magának a fluoreszcens molekulának a velejárója. A fluoreszcencia élettartamot használó képalkotás technológiáját Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) néven nevezik, amely a fluoreszcencia intenzitású képalkotás mellett mélyebb funkcionális és pontosabb méréseket is végezhet molekuláris konformáció, intermolekuláris kölcsönhatások és molekuláris mikrokörnyezetek elérése érdekében. olyan információkat, amelyeket a hagyományos optikai képalkotással nehéz megszerezni.
A fluoreszcencia másik fontos tulajdonsága a Stokes-eltolódás, a gerjesztési és emissziós csúcsok közötti hullámhossz-különbség (2. ábra). Általában az emissziós fény hullámhossza hosszabb, mint a gerjesztő fény hullámhossza. Ennek az az oka, hogy a fluoreszcens anyag gerjesztése és a foton felszabadulása előtt az elektronok elveszítik az energiájuk egy részét a relaxációs folyamat során. A nagyobb Stokes-eltolódású fluoreszcens anyagok könnyebben megfigyelhetők fluoreszcens mikroszkóp alatt.
Fluoreszcens mikroszkópok és fluoreszcens szűrőblokkok
A fluoreszcens mikroszkóp egy optikai mikroszkóp, amely fluoreszcens tulajdonságokat használ megfigyelésre és képalkotásra, és széles körben használják a sejtbiológiában, neurobiológiában, botanikában, mikrobiológiában, patológiában, genetikában és más területeken. A fluoreszcens képalkotás előnyei a nagy érzékenység és nagy specificitás, és nagyon alkalmas specifikus fehérjék, organellumok stb. szövetekben és sejtekben való eloszlásának megfigyelésére, a ko-lokalizáció és kölcsönhatás vizsgálatára, valamint az életdinamika nyomon követésére. olyan folyamatok, mint az ionkoncentráció változása.
A sejtekben a legtöbb molekula nem fluoreszkál, és ahhoz, hogy láthassák őket, fluoreszcens jelöléssel kell ellátni őket. Számos módszer létezik a fluoreszcens jelölésre, amelyek közvetlenül jelölhetők (például DAPI használata a DNS jelölésére), vagy immunfestés az antitestek antigénkötő tulajdonságainak felhasználásával, vagy a célfehérje jelölhető fluoreszcens fehérjékkel (például GFP, zöld). fluoreszcens fehérje), vagy reverzibilis kötődés. szintetikus színezékek (például Fura{1}}) stb.
A fluoreszcens mikroszkóp mára a különböző laboratóriumok és képalkotó platformok standard képalkotó berendezése lett, és jó segítője mindennapi kísérleteinknek. A fluoreszcens mikroszkópok alapvetően három kategóriába sorolhatók: függőleges fluoreszcens mikroszkópok (metszetvágásra alkalmas), fordított fluoreszcens mikroszkópok (élő sejtek számára alkalmasak, metszetek figyelembevételével), fluoreszcens sztereoszkópikus mikroszkópok (nagyobb minták, például növények, zebradánok (felnőtt/felnőtt) embrió), medaka, egér/patkány szervek stb.).
A fluoreszcens szűrőblokk a mikroszkópos fluoreszcens képalkotás központi eleme. Egy gerjesztőszűrőből, egy emissziós szűrőből és egy dikroikus sugárosztóból áll. A szűrőkerékbe van beépítve, mint például a Leica DMi8, amely 6-pozíciószűrő kerékkel van felszerelve (3. ábra). ). A különböző mikroszkópok különböző kerekekkel rendelkeznek, és egyes mikroszkópok szűrőlemezeket használnak.
A szűrőblokk fontos szerepet játszik a fluoreszcens képalkotásban: a gerjesztő szűrő kiválasztja a gerjesztő fényt a minta gerjesztéséhez, és blokkolja a fény más hullámhosszait; a gerjesztőszűrőn áthaladó fény egy dikroikus nyalábosztón halad át (annak szerepe a gerjesztő fény visszaverése és a fluoreszcencia átadása), visszaverődés után az objektív lencséjével fókuszálják, besugározzák a mintára, és a megfelelő fluoreszcenciát gerjesztik fényt bocsátanak ki. A kibocsátott fényt az objektívlencse összegyűjti, áthalad a dikroikus sugárosztón, és eléri az emissziós szűrőt. A 4. ábrán látható: a gerjesztési hullámhossz 450-490 nm, a dikroikus nyalábosztó 510 nm-nél rövidebb fényt veri vissza, 510 nm-nél hosszabb fényt enged át, és az emissziós fény vételi tartománya 520-560 nm.
A fluoreszcens mikroszkópokban általánosan használt fluoreszcens szűrők két típusra oszthatók: long pass (röviden LP) és sáváteresztő (röviden BP). A sáváteresztőt általában a központi hullámhossz és az intervallum szélessége határozza meg, például 480/40, ami azt jelenti, hogy 460-500nm-es fény áthaladhat. A hosszú áteresztő szűrők, mint például az 515 LP, 515 nm-nél hosszabb hullámhosszú fényt bocsátanak át (5. ábra).
A fluoreszcens anyagoknak megvan a jellegzetes gerjesztési (abszorpciós) görbéjük és emissziós görbéjük, a gerjesztési csúcs az ideális gerjesztési hullámhossz (nagy gerjesztési hatásfok, ami csökkentheti a gerjesztési fényenergiát, védi a sejteket és a festékeket), az emissziós görbe pedig az emissziós fluoreszcencia hullámhossz. hatótávolság. Ezért a kísérletben a gerjesztéshez a lehető legközelebbi hullámhosszt választjuk a gerjesztési csúcshoz, és a vételi tartománynak tartalmaznia kell az emissziós csúcsot. Például az Alexa Fluor 488 gerjesztési csúcsa 500 nm, a 480/40 gerjesztőszűrő pedig kiválasztható a fluoreszcens mikroszkópban.
A szűrőkockák részletei a mikroszkóp képalkotó szoftverben tekinthetők meg. A színezékek megértése és a mintájához legjobban illő szűrő megtalálása kritikus fontosságú a fluoreszcens képalkotáshoz. A fluoreszcens festékek és fluoreszcens fehérjék spektrális információi általában az utasításokban vannak feltüntetve, és az interneten is megtalálhatók.
A szűrőblokkok kiválasztásánál a fluoreszcens szondák gerjesztési és emissziós hullámhosszain kívül azt is figyelembe kell venni, hogy van-e nem specifikus gerjesztés, és van-e keresztszín a többszínű jelzésű mintáknál. Ezenkívül figyelembe kell venni a használt fluoreszkáló fényforrást. Jelenleg a leggyakrabban használt fluoreszkáló fényforrások közé tartoznak a higanylámpák, a fémhalogén lámpák és az elmúlt években gyorsan fejlődő LED fényforrások. A fluoreszkáló fényforrás spektruma folytonos vagy nem folytonos, és az energia különböző hullámhosszúságú sávokban eltérő lesz. A LED fényforrás fokozatosan a fluoreszcens mikroszkóp fő fényforrásává válik viszonylag szűk spektrális sávja, stabilabb energiakibocsátása, hosszú élettartama, biztonságosabb és környezetvédelme és számos egyéb előnye miatt.
A mikroszkóp beépített szűrőblokkján kívül van egy külső gyorskerék is (7. ábra). A Leica külső gyorskereke melletti szűrő konverziós sebessége 27 ms, amellyel nagy sebességű többszínű kísérletek valósíthatók meg, mint például a FRET és Fura2 arányú kalcium képalkotás. (8. ábra) et al.
Fluoreszcens mikroszkópos képalkotási technikák széles választéka
A különböző fluoreszcens képalkotási igények kielégítésére a fluoreszcens mikroszkópok mellett különféle fluoreszcens mikroszkópos képalkotó megoldásokat fejlesztettek ki:
A széles látószögű nagyfelbontású képalkotó rendszerek, mint például a Leica THUNDER Imager, a Leica innovatív Clearing technológiáját használják a nem fókuszsík interferencia jelek hatékony eltávolítására képalkotás közben, tiszta képeket és a nagy sebességű képalkotás előnyeit biztosítva;
A konfokális lézeres pásztázó mikroszkóp tűlyukakat használ a nem fókuszsík interferenciák kiküszöbölésére, optikai metszeteket valósít meg, és nagy felbontású képeket és háromdimenziós képeket készít;
A diffrakciós határt áttörő ultranagy felbontású mikroszkópok és nanomikroszkópok 200 nm-nél kisebb finomszerkezeteket is megfigyelhetnek;
Többfoton képalkotó rendszer a többfoton gerjesztés elvét alkalmazva vastag szövetek és mély in vivo képalkotásra;
Fénylemezes képalkotó technológia nagy időbeli és térbeli felbontással, gyors képalkotási sebességgel, nagy felbontással, alacsony fototoxicitással, különösen alkalmas fejlesztési kutatásokra és in vivo dinamikus megfigyelésre;
A fluoreszcens élettartam képalkotás (FLIM), amelyet nem befolyásolnak olyan tényezők, mint a fluoreszcens anyag koncentrációja, a fényfehérítés, a gerjesztő fény intenzitása stb., mélyebb funkcionális és pontosabb méréseket végezhet;
A fluoreszcens korrelációs spektroszkópia (FCS) és a fluoreszcencia keresztkorrelációs spektroszkópia (FCCS) méri a fluoreszcens molekulák molekulaszámát és diffúziós együtthatóját, ezáltal elemzi a molekulakoncentrációt, a molekulaméretet, a viszkozitást, a molekulamozgást, a molekulakötést/disszociációt, és a molekulák optikai tulajdonságait;
A rendkívül magas z-tengely felbontású Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRF) ideális a sejtmembránfelületek molekuláris szerkezetének és dinamikájának tanulmányozására.
