A fluoreszcens mikroszkópia alapelvei
A fluoreszcens mikroszkópok különböznek a hagyományos optikai mikroszkópoktól. Ahelyett, hogy a mintákat közönséges fényforrások megvilágítása mellett figyelnék meg, bizonyos hullámhosszú fényt (általában ultraibolya fényt, kéklila fényt) használnak a mintákban lévő fluoreszcens anyagok mikroszkóp alatti gerjesztésére, hogy azok fluoreszcenciát adjanak ki. Ezért a fluoreszcens mikroszkóp fényforrása nem közvetlen megvilágításként működik, hanem energiaforrásként, amely gerjeszti a mintán belüli fluoreszcens anyagokat. A próbatest megfigyelésének oka a fényforrás megvilágítása, de a mintában lévő fluoreszcens anyag után megjelenő fluoreszcencia jelenség elnyeli a gerjesztett fényenergiát.
Látható, hogy a fluoreszcens mikroszkóp jellemzője, hogy fényforrása adott hullámhossz-tartományban nagy mennyiségű gerjesztő fényt képes ellátni, így a vizsgált próbatestben lévő fluoreszcens anyag a szükséges intenzitású gerjesztő fényt kapja. Ugyanakkor a fluoreszcens mikroszkópnak rendelkeznie kell a megfelelő szűrőrendszerrel.
A fluoreszcens mikroszkópia elengedhetetlen eszköz az immunfluoreszcens hisztokémiában. Ultra-nagyfeszültségű fényforrásból, szűrőrendszerből (beleértve a gerjesztő és elnyomó szűrőlemezt), optikai rendszerből és fényképezési rendszerből, valamint egyéb fő alkatrészekből áll. Egy bizonyos hullámhosszú fényt használ a minta gerjesztésére, hogy fluoreszcenciát bocsásson ki.
A fluoreszcencia gerjesztésének módja: A fény hullámhossz-tartománya szerint két típusra osztható: UV-gerjesztési módszerre (ultibolya megvilágítási módszerrel) és BV-gerjesztési módszerre (kék-ibolya fénnyel). Az UV gerjesztési módszer 400 nm-nél rövidebb, közeli ultraibolya fényt használ a gerjesztéshez. Ennél a módszernél nincs látható gerjesztő fény, így a megfigyelt fluoreszcencia a festék inherens fluoreszcenciáját mutatja, és könnyen megkülönböztethető a mintán lévő specifikus fluoreszcenciája a háttérszövet autofluoreszcenciájától.
A BV gerjesztési módszer 404 nm-en és 434 nm-en alapul az ultraibolya fénytől a kék fényig történő gerjesztéshez. Ez a módszer kék fényt használ a minta besugárzására, ezért a fluoreszcencia-megfigyelő rendszer cut-off szűrőjének olyan szűrőt kell használnia, amely teljesen blokkolja a kék fényt, és teljes mértékben átengedi a szükséges zöld és sárga fluoreszcenciát. Fluoreszcens festékek fluoreszcens antitest vizsgálatokhoz. A gerjesztő fény maximális abszorpciós hullámhossza viszonylag közel van a fluoreszcencia maximális emissziós hullámhosszához, ezért a BV gerjesztési módszernél használt szűrőnek éles vágási szűrőt kell használnia. Ezzel a módszerrel gerjesztő fényként kék fény használható, így a fluoreszcens pigment abszorpciós hatásfoka nagyobb, és világosabb képet kaphatunk. Hátránya, hogy az 500 nm alatti fluoreszcencia nem látható, az 500 nm feletti fluoreszcencia pedig az egész képet sárgává teszi. A fluoreszcens antitest módszerben a fluorokróm specificitását gyakran a fluorokróm egyedi színe alapján ítélik meg. Ezért a finom specifitás tárgyalásakor a BV gerjesztési módszer fent említett hiányosságai gyakran nagy hatással vannak.
Összegezve, a fluoreszcens mikroszkóp megvilágítását a kondenzátor szerkezete és a gerjesztő fény hullámhossza szerint a következő három pont szerint vehetjük figyelembe.
① A fluoreszkáló kép kontrasztkövetelményei szempontjából az UV gerjesztésű sötéttér-koncentrátort használják megvilágításra.
② Figyelembe véve a kép fényerejét, a BV gerjesztő szűrő rendelkezik a legmagasabb sötétmező-megfigyelési hatékonysággal.
③Az UV gerjesztőszűrős sötéttér-megfigyelés és a BV-gerjesztésű sötéttér-koncentrátoros megvilágítás jellemzői e két megvilágítási mód közé sorolhatók, de az előbbi erősebb sötéttér-tulajdonságokkal rendelkezik, és világosabb képeket jelenít meg. A kontraszt kicsi; ez utóbbi megőrzi a sötét mező fényútjának tulajdonságait, így a megjelenített kép sötétebb, a kontraszt pedig javul. Fluoreszcens mikroszkóp tényleges használata esetén a minta követelményeinek leginkább megfelelő megvilágítási módszert kell használni a megfigyeléshez.
Figyelembe kell venni, hogy még ha a legjobb kontrasztú UV-gerjesztésű sötét mezős kondenzátor meg is van világítva, a minta által megtört vagy szórt ultraibolya gerjesztő fény egy része bejut az objektívbe. Az autofluoreszcencia ronthatja a képválaszt. Ezért a szemlencse előtt UV-elnyelő szűrőt kell használni, mint levágási szűrőt.
