Multifoton mikroszkópok fókuszmélységének növelésének módszerei
A két{0}}fotonlézeres pásztázó mikroszkóp és a kalciumindikátor kombinációja az in vivo neuronális jelek detektálásának aranystandardja. A neurális hálózatokban a neuronok háromdimenziós térben oszlanak el, és tevékenységük dinamikájának figyeléséhez olyan módra van szükség, amellyel gyorsan javítható a térfogati képalkotási sebesség. Ha azonban rácsos pásztázó multifoton mikroszkópot használunk nagyszámú kép elkészítéséhez, ha nagy numerikus apertúrájú (NA) objektívet használunk a nagyobb oldalsó felbontás eléréséhez, az kisebb fókuszmélységet eredményez. A térfogati képalkotás kis fókuszmélységben történő készítése érdekében
Szükséges a Z-tengely pásztázása bizonyos eszközökön keresztül, sok sík leképezése minden fókuszsík pásztázásával, ami nagymértékben korlátozza a képalkotás sebességét. Ha az axiális képinformáció feláldozható, és a fókuszmélység kiterjesztésével egy oldalsó pásztázással térfogati szkennelés érhető el, vagyis a térfogatinformáció egyetlen 2D-s képre vetítésre kerül, a képalkotás sebessége nagymértékben javítható. Ezt az úgynevezett Extended Depth of Focus (EDF) képalkotást, amely különösen hasznos olyan ritka populációs struktúrák képalkotására, amelyek nagy időbeli felbontást igényelnek, mint például a neuronális aktivitás funkcionális képalkotása.
A mikroszkóp tengelyirányú és oldalirányú felbontását az objektívlencse numerikus apertúrája (NA) határozza meg. A magas NA maximalizálhatja az axiális és oldalirányú felbontást, valamint az összegyűjtött fény mennyiségét; Az alacsonyabb NA alacsonyabb axiális felbontást, azaz nagyobb fókuszmélységet eredményez, ugyanakkor feláldozza az oldalirányú felbontást és a fénygyűjtés hatékonyságát. A fókuszmélység kiterjesztésének következő módszerével ez a nagy oldalirányú felbontás és a megfelelő fényáram megőrzése mellett érhető el.
A térbeli fénymodulátorok használatával fókuszált, karcsú Bessel-sugarak generálhatók EDF képalkotás, de a térbeli fénymodulátorok terjedelmesek, és nehezen kompatibilisek a szűk mikroszkópterekkel; Ezzel szemben az axiális piramisokra épülő Bessel-modulok olcsók és kompaktak, de csak fix mélységű fókuszpontokat tudnak létrehozni, és nem alkalmasak különféle, a fókuszmélység folyamatos változtatását igénylő kísérletekre. A probléma megoldása érdekében 2018-ban RONGWEN LU et al. bemutatott egy axikonon alapuló Bessel-modult, amelyben csak egy lencsét kell az optikai tengely mentén fordítani a Bessel-fókuszpont tengelyhosszának folyamatos beállításához.
1. ábra a) Bessel-modul eszközdiagramja; (b) A pontszórási függvényt kísérletileg mértük, amikor D értéke -12 mm, 0 mm, illetve 12 mm; (c) Az oldalsó teljes szélesség a maximum felénél, (d) a tengelyirányú teljes szélesség a maximum felénél, (e) a csúcsjel és (f) az objektívlencse mögötti optikai teljesítmény D L2 elmozdulással
A változó hosszúságú Bessel-fókuszpont kialakítására szolgáló moduleszköz az 1a. ábrán látható. A beeső Gauss-nyaláb egy axikonon és az L1 lencsén való áthaladás után kör alakú sugárrá alakul. Az ezt követő, körkörös rekesznyílású maszk blokkolhatja az axikonhibák által okozott szórt fényt, ezáltal alakítva a két-foton gerjesztési pont terjedési függvényének axiális eloszlását. Ezt követően a fénysugarat az L2 és L3 lencsék a galvanométerre vetítik, majd az L4 és L5 lencséken keresztül elérik az objektív hátsó fókuszsíkját.
Ezek a kialakítások hasonlóak a hagyományos piramis alapú modulokhoz, azzal a különbséggel, hogy az L2 vagy L3 optikai tengely mentén történő mozgatásával a Bessel-fókusz tengelyirányú hossza folyamatosan állítható. Az 1b. ábra a tengelyirányú pontszórás függvényeit mutatja -12 mm, 0 mm és 12 mm-es D értékek esetén, a tengelyirányú teljes szélesség felénél 39? m,24? M és 14? m. Amint az 1c-f ábrán is látható, az L2 lencse balról jobbra mozgatásával a teljes szélesség folyamatosan, maximum fele változtatható mind keresztirányú, mind axiális irányban, ami azt jelenti, hogy a fókuszmélység folyamatosan változtatható. A vektordiffrakciós elméleten alapuló numerikus szimulációs eredmények jó egyezést mutatnak a kísérleti adatokkal. A 2. ábra igazolja a különböző méretű gyűrű alakú maszkok korrekciós hatását az axikonhibákra. Azt találtuk, hogy a vékonyabb gyűrű alakú maszkok jobban optimalizálhatják a kimenő Bessel-nyaláb axiális intenzitáseloszlását, ugyanakkor nagyobb teljesítményveszteséghez is vezetnek.
