A lézeres konfokális mikroszkóp jellemzői és alkalmazásai
Míg normál mikroszkópban a megfigyelés képsíkja a szomszédos tengelyirányú síkoktól úgy van elválasztva, hogy az objektív lencse fókuszsíkját átfedi a detektorral, addig a konfokális mikroszkópban ezt az elkülönítést úgy érjük el, hogy a mintát egy diffrakció-korlátozott ponttal megvilágítjuk. fényt és szórt fényt szűrni az összegyűjtött fény útjában lévő tűlyuk segítségével ennek a fénypontnak a konjugált fókuszában, hogy elérje ezt az izolációt és ezáltal javítsa a felbontást.
Csak a konjugált mintarétegről visszaverődő fény tud áthaladni a gyűjtőfényútban lévő tűlyukon, míg a többi irreleváns mintaréteg visszaverődését a tűlyuk blokkolja. Ez jelentősen növeli a felbontást. Az alábbiakban ugyanazon vastag minta többdimenziós fluoreszcens mikroszkópiájának és konfokális mikroszkópiájának egymás melletti összehasonlítása látható. Amikor különböző fókuszsíkon képeket készítenek, egy „z-stack”-ként emlegetett kép keletkezik, amely megmutatja a konfokális mikroszkópos vizsgálat által biztosított felbontás- és kontrasztnövekedést, valamint ennek okait. Látható, hogy a halom tetején lévő képet vizsgálva, ahol a képalkotó sík a szövet felett van, nagy mennyiségű szórt fényt mutat a fluoreszcens képen, míg a konfokális mikroszkópos kép feketének tűnik. A PSF ezen tengelyirányú csökkenése közvetlenül hozzájárul a z-verem közepén lévő optikai interfésznél megfigyelt felbontásbeli különbséghez.
Optikai szeletleolvasó képalkotás
A lézeres pásztázó konfokális mikroszkópia másik jellemzője, hogy pásztázó képalkotási technika. A hagyományos széles látómezős megvilágítási technikák a teljes mintát megvilágítják, így a képet szabad szemmel vagy detektorral közvetlenül rögzíteni lehet, de az LSCM egy vagy több fókuszált fénysugarat használ a mintán való pásztázáshoz, így a kapott képet ún. optikai szelet, amint az a következő ábrán látható. A hagyományos széles látómezős megvilágítás és a lézeres pásztázó konfokális megvilágítás közötti különbség az alábbiakban látható.
Ezért az alábbi ábra a modern konfokális mikroszkópia gyakorlati módját mutatja be. A lézer gerjesztő fénye áthalad egy dikroikus tükörön, és a minta x- és y-irányában egy galvanométer-tükör páron pásztázik, majd a minta gerjesztése (vagy visszaverődése) egy tűlyukon át a PMT-be jut. detektort kell rögzíteni, és a rögzített szkennelt képet egy számítógép rekonstruálja, hogy a mintáról tényleges képet készítsen.
