Konfokális fluoreszcens mikroszkóppal kapcsolatos ismeretek
A konfokális fluoreszcens mikroszkópia alapelve, hogy pontszerű fényforrást használnak a minta besugárzására, jól körülhatárolható kis foltot képezve a fókuszsíkon. A besugárzás után a folt által kibocsátott fluoreszcenciát az objektívlencse összegyűjti, és az eredeti besugárzási útvonal mentén visszaküldi a kétirányú színtükörből álló spektrofotométerhez. A spektrofotométer közvetlenül a detektorba küldi a fluoreszcenciát. A fényforrás és az érzékelő előtt két lyuk található, ezeket megvilágítási tűlyukak és érzékelési tűlyukak nevezik. A kettő geometriai méretei konzisztensek, körülbelül 100-200nm; A fókuszsíkon lévő fényponthoz képest a kettő konjugált, ami azt jelenti, hogy a fénypont egy sor lencsén halad át, és végül egyszerre fókuszálhat a megvilágítási tűlyukra és az érzékelési tűlyukra. Ily módon a fókuszsíkból érkező fény az érzékelési lyukon belül konvergálhat, míg a fókuszsík felett vagy alatt szórt fény az érzékelési lyukon kívül blokkolva van, és nem lehet leképezni. A minta lézerrel pontról pontra történő pásztázásával a fénysokszorozó cső a tűlyuk észlelése után pontról pontra megkapja a fény megfelelő konfokális képét is, amelyet digitális jellé alakítva továbbít a számítógépnek. Végül a teljes fókuszsík tiszta konfokális képe szintetizálódik a képernyőn.
Minden egyes fókuszsík kép valójában a próbatest optikai keresztmetszete, amelynek mindig van egy bizonyos vastagsága, más néven optikai vékony metszet. Tekintettel arra, hogy a fókuszpontban a fény intenzitása sokkal nagyobb, mint a nem fókuszpontban, és a nem fókuszsíkú fényt lyukak szűrik ki, a konfokális rendszer mélysége megközelítőleg nulla. A Z-tengely irányú pásztázásával optikai tomográfiát lehet elérni, kétdimenziós optikai szeletet képezve a megfigyelt minta fókuszpontjában. Az XY sík (fókuszsík) szkennelés Z-tengelyes (optikai tengely) szkenneléssel kombinálva kétdimenziós képek folyamatos rétegeinek felhalmozásával és speciális számítógépes szoftverrel történő feldolgozásával háromdimenziós kép nyerhető a mintáról.
Az érzékelési tűlyuk és a fényforrás tűlyuk mindig ugyanarra a pontra fókuszálnak, így a fókuszsíkon kívül gerjesztett fluoreszcencia nem juthat be az érzékelési tűlyukba.
A lézeres konfokális mikroszkóp működési elvének egyszerű kifejeződése, hogy fényforrásként lézert használ, és a hagyományos fluoreszcens mikroszkópos képalkotáson alapuló lézerszkennert és konjugált fókuszáló készüléket egészít ki. Ez egy számítógép által vezérelt rendszer a digitális képfelvételhez és -feldolgozáshoz.
