Különbség a közönséges mikroszkóp és a fluoreszcens mikroszkóp között
A fluoreszcens mikroszkópok ultraibolya fényt használnak fényforrásként a vizsgálandó tárgy besugárzására, így a tárgy fényt bocsát ki, majd a tárgyat mikroszkóp alatt figyelik meg. Főleg immunfluoreszcens sejtekhez használják. Főleg egy fényforrásból, egy szűrőlemez-rendszerből és egy optikai rendszerből áll, amely a minta fluoreszcens képét a szemlencse és az objektív nagyításán keresztül figyeli. Nézzük meg, mi a különbség ez a fluoreszcens mikroszkóp és egy közönséges optikai mikroszkóp között.
1. A világítási módok tekintetében
A fluoreszcens mikroszkóp megvilágítási módja általában episzkopikus, azaz a fényforrást az objektíven keresztül vetítik a vizsgált mintára.
2. Felbontás szempontjából
A fluoreszcens mikroszkópok ultraibolya fényt használnak fényforrásként. A hullámhossz viszonylag rövid, de a felbontás nagyobb, mint a hagyományos optikai mikroszkópoké.
3. A különbség a szűrőben
A fluoreszcens mikroszkóp két speciális szűrőt használ, amelyeket a fényforrás előtt használnak a látható fény kiszűrésére, az objektívlencse és a szemlencse között pedig az ultraibolya fény kiszűrésére, amely védheti az emberi szemet.
A fluoreszcens mikroszkóp egyfajta optikai mikroszkóp is, főként azért, mert a fluoreszcens mikroszkóp által gerjesztett hullámhossz rövid, így ez a fluoreszcencia mikroszkóp és a közönséges mikroszkóp szerkezeti és felhasználási különbségéhez vezet. A legtöbb fluoreszcens mikroszkóp jó funkcióval rendelkezik a gyenge fény rögzítésére, így rendkívül gyenge fluoreszcencia esetén is jó a képalkotó képessége. A fluoreszcenciás mikroszkópok elmúlt évekbeli folyamatos fejlesztésével párosulva a zaj is jelentősen csökkent. Ezért egyre több fluoreszcens mikroszkópot használnak.
Kétfoton fluoreszcencia mikroszkópos ismeretek
A kétfotonos gerjesztés alapelve: nagy fotonsűrűség esetén a fluoreszcens molekulák egyszerre két hosszú hullámhosszú fotont tudnak elnyelni, és rövid, úgynevezett gerjesztett állapotú élettartam után egy rövidebb hullámhosszúságú fotont bocsátanak ki. . ; a hatás ugyanaz, mintha egy fluoreszcens molekula gerjesztésére olyan fotont használnánk, amelynek hullámhossza fele a hosszú hullámhossznak. A kétfotonos gerjesztéshez nagy fotonsűrűség szükséges. A sejtek károsodásának elkerülése érdekében a kétfotonos mikroszkópiában nagy energiájú üzemmódban zárt impulzuslézereket használnak. A lézer által kibocsátott lézer magas csúcsenergiával és alacsony átlagos energiával rendelkezik, impulzusszélessége mindössze 100 femtoszekundum, frekvenciája pedig elérheti a 80-100 megahertzet. Ha nagy numerikus apertúrájú objektívet használunk az impulzuslézer fotonjainak fókuszálására, az objektív gyújtópontjában a fotonsűrűség a legnagyobb, és a kétfotonos gerjesztés csak az objektív gyújtópontjában következik be, így a kétfoton mikroszkóphoz nincs szükség konfokális tűlyukra, ami javítja a fluoreszcencia detektálási hatékonyságot.
Az általános fluoreszcencia jelenségeknél a gerjesztő fény alacsony fotonsűrűsége miatt egy fluoreszcens molekula egyszerre csak egy fotont képes elnyelni, majd sugárzási átmeneten keresztül fluoreszcens fotont bocsát ki, ami egyfoton fluoreszcencia. A lézert fényforrásként használó fluoreszcens gerjesztési eljárásnál két- vagy akár többfoton fluoreszcencia is előfordulhat. Ekkor az alkalmazott gerjesztő fényforrás intenzitása nagy, a fotonsűrűség pedig megfelel a két fotont egyszerre elnyelő fluoreszcens molekulák követelményeinek. Az általános lézer gerjesztő fényforrásként történő alkalmazása során a fotonsűrűség még mindig nem elegendő a kétfoton abszorpciós jelenség kialakulásához. Általában femtoszekundumos impulzuslézert használnak, amelynek pillanatnyi teljesítménye elérheti a megawatt nagyságrendet. Ezért a kétfoton fluoreszcencia hullámhossza rövidebb, mint a gerjesztő fény hullámhossza, ami megegyezik a gerjesztési hullámhossz felénél jelentkező gerjesztéssel.
A kétfoton fluoreszcens mikroszkópiának számos előnye van:
1) A hosszú hullámhosszú fényt kevésbé befolyásolja a szóródás, mint a rövid hullámhosszú fényt, és könnyen áthatol a mintán;
2) A fókuszsíkon kívüli fluoreszcens molekulák nincsenek gerjesztve, így több gerjesztőfény érheti el a fókuszsíkot, így a gerjesztő fény mélyebb mintákba tud behatolni;
3) A hosszú hullámhosszú közeli infravörös fény kevésbé mérgező a sejtekre, mint a rövid hullámhosszú fény;
4) Ha kétfotonos mikroszkópot használunk a minták megfigyelésére, a fényfehéredés és a fototoxicitás csak a fókuszsíkban fordul elő. Ezért vastag minták megfigyelésére, élő sejtek megfigyelésére vagy foltos fényfehérítési kísérletekre alkalmasabb a kétfotonos mikroszkóp, mint az egyfoton mikroszkóp.
Konfokális fluoreszcens mikroszkópos ismeretek
A konfokális fluoreszcens mikroszkópia alapelve: pontszerű fényforrással sugározzák be a mintát, és a fókuszsíkon egy jól körülhatárolható kis fényfolt alakul ki. osztókból áll. A sugárosztó a fluoreszcenciát közvetlenül a detektorba küldi. A fényforrás és a detektor előtt van egy tűlyuk, amelyet megvilágítási tűlyuknak, illetve érzékelő tűlyuknak neveznek. A kettő geometriai mérete megegyezik, körülbelül 100-200nm; a fókuszsíkon lévő fényfolthoz viszonyítva a kettő konjugált, vagyis a fényfolt egy sor lencsén halad át, és végül egyszerre fókuszálható a megvilágító tűlyukra és az érzékelési tűlyukra. Ily módon a fókuszsíkból érkező fény az érzékelési lyukon belül konvergálható, míg a fókuszsík felett vagy alatt szórt fény az érzékelési lyukon kívül blokkolva van, és nem leképezhető. A lézer pontról pontra pásztázza a mintát, és a fénysokszorozó cső a tűlyuk észlelése után pontról pontra megkapja a megfelelő fénypont konfokális képét is, amelyet digitális jellé alakítva továbbít a számítógépnek, végül tiszta képpé aggregálódik. a teljes fókuszsík konfokális képe a képernyőn .
Minden egyes fókuszsík kép valójában a minta optikai keresztmetszete. Ennek az optikai keresztmetszetnek mindig van egy bizonyos vastagsága, más néven optikai vékony metszet. Mivel a fókuszpontban a fény intenzitása sokkal nagyobb, mint a nem fókuszpontban, és a nem fókuszsík fényét a tűlyuk szűri, a konfokális rendszer mélységélessége megközelítőleg nulla, és a Z mentén pásztázva. -tengely segítségével optikai tomográfia valósítható meg, amely a minta fókuszpontjában a kétdimenziós optikai metszetet képezi. Az XY sík (fókuszsík) szkennelést Z-tengelyes (optikai tengelyes) szkenneléssel kombinálva a minta háromdimenziós képe folyamatos rétegek kétdimenziós képeinek összegyűjtésével és speciális számítógépes szoftverrel feldolgozható.
Azaz a detektáló tűlyuk és a fényforrás tűlyuk mindig ugyanarra a pontra fókuszálnak, így a fókuszsíkon kívül gerjesztett fluoreszcencia nem juthat be a detektáló tűlyukba.
A lézeres konfokális működési elvének egyszerű kifejeződése, hogy fényforrásként lézert használ, és a hagyományos fluoreszcens mikroszkópos képalkotás alapján lézeres leolvasó eszközzel és konjugált fókuszáló eszközzel egészül ki, valamint egy rendszer a digitális képalkotáshoz, ill. feldolgozás számítógépes vezérléssel.
