Különbség a fluoreszcens mikroszkóp és a normál mikroszkóp között
1. Nézd meg a világítási módot
A fluoreszcens mikroszkóp megvilágítási módja általában epi-típusú, vagyis a fényforrást az objektíven keresztül helyezik a vizsgálandó mintára.
2. Nézd meg a felbontást
A fluoreszcens mikroszkópok ultraibolya fényt használnak fényforrásként, viszonylag rövid hullámhosszúsággal, de a felbontás nagyobb, mint a hagyományos optikai mikroszkópoké.
3, a különbség a szűrőben
A fluoreszcens mikroszkóp két speciális szűrőt használ, amelyeket a fényforrás előtt használnak a látható fény kiszűrésére, az objektívlencse és a szemlencse között pedig az ultraibolya fény kiszűrésére, amely védi az emberi szemet.
A fluoreszcens mikroszkóp is egyfajta optikai mikroszkóp, főként azért, mert a fluoreszcens mikroszkóp által gerjesztett hullámhossz rövid, így ez a fluoreszcens mikroszkóp és a közönséges mikroszkóp szerkezetének és felhasználásának különbségéhez vezet. A legtöbb fluoreszcens mikroszkóp jó funkcióval rendelkezik a gyenge fény rögzítésére. , tehát rendkívül gyenge fluoreszcencia mellett a képalkotó képessége is jó. A fluoreszcenciás mikroszkópia elmúlt években tapasztalt folyamatos fejlesztésével párosulva a zaj is jelentősen csökkent. Ezért egyre több fluoreszcens mikroszkópot használnak.
A kétfoton fluoreszcens mikroszkópia ismerete
A kétfotonos gerjesztés alapelve: nagy fotonsűrűség esetén a fluoreszcens molekulák egyszerre két hosszú hullámhosszú fotont is képesek elnyelni, és nagyon rövid, úgynevezett gerjesztett állapotú élettartam után rövid hullámhosszú fotont bocsátanak ki. ; a hatás ugyanaz, mintha egy fotont használnánk a hosszú hullámhossz fele hullámhosszúságú fluoreszcens molekula gerjesztésére. A kétfotonos gerjesztéshez nagy fotonsűrűségre van szükség, és a sejtek károsodásának elkerülése érdekében a kétfotonos mikroszkópiához nagy energiájú üzemmódban zárt impulzuslézereket használnak. Ez a lézer magas csúcsenergiájú és alacsony átlagos energiájú lézerfényt bocsát ki, impulzusszélessége mindössze 100 femtoszekundum, frekvenciája pedig 80-100 MHz. Ha nagy numerikus apertúrájú objektívlencsét használnak az impulzuslézer fotonjainak fókuszálására, a fotonsűrűség az objektív gyújtópontjában a legnagyobb, és a kétfotonos gerjesztés csak az objektív gyújtópontjában történik, így a kétfotonos mikroszkópnak nincs szüksége konfokális tűlyukra, ami javítja a fluoreszcencia detektálási hatékonyságot.
Az általános fluoreszcencia jelenségben a gerjesztő fény alacsony fotonsűrűsége miatt egy fluoreszcens molekula egyszerre csak egy fotont képes elnyelni, majd a sugárzási átmeneten keresztül egy fluoreszcens fotont bocsát ki, amit egyfoton fluoreszcenciának nevezünk. A lézeres fényforrással végzett fluoreszcens gerjesztési eljárásnál két- vagy akár többfoton fluoreszcencia jelenség is előfordulhat. Ekkor az alkalmazott gerjesztő fényforrás intenzitása nagy, a fotonsűrűség pedig megfelel annak a követelménynek, hogy a fluoreszcens molekula egyszerre két fotont nyeljen el. Az általános lézer gerjesztő fényforrásként történő alkalmazása során a fotonsűrűség még mindig nem elegendő a kétfotonos abszorpció létrehozásához. Általában femtoszekundumos impulzuslézert használnak, amelynek pillanatnyi teljesítménye elérheti a megawatt nagyságrendet. Ezért a kétfoton fluoreszcencia hullámhossza rövidebb, mint a gerjesztő fény hullámhossza, ami ekvivalens a fél gerjesztés hullámhosszú gerjesztése által keltett hatással.
A kétfoton fluoreszcens mikroszkópiának számos előnye van:
1) A hosszú hullámhosszú fényt kevésbé befolyásolja a szóródás, mint a rövid hullámhosszú fényt, és könnyen áthatol a mintán;
2) A fókuszsíkon kívüli fluoreszcens molekulák nincsenek gerjesztve, így több gerjesztőfény érheti el a fókuszsíkot, így a gerjesztő fény mélyebb mintákba tud behatolni;
3) A hosszú hullámhosszú közeli infravörös fény kevésbé mérgező a sejtekre, mint a rövid hullámhosszú fény;
4) A minták kétfoton-mikroszkópos vizsgálatakor a fényfehérítés és a fototoxicitás csak a fókuszsíkban van jelen. Ezért a kétfotonos mikroszkópia alkalmasabb vastag minták megtekintésére, mint az egyfotonos mikroszkóp, élő sejtek megtekintésére, vagy fixpontos fényfehérítési kísérletek elvégzésére.
Konfokális fluoreszcens mikroszkópos ismeretek
A konfokális fluoreszcens mikroszkópia alapelve: pontszerű fényforrás segítségével a minta megvilágítására egy jól körülhatárolható körvonalú kis fényfolt alakul ki a fókuszsíkon. a sugárosztóból áll. A sugárosztó a fluoreszcenciát közvetlenül a detektorba küldi. A fényforrás és a detektor előtt van egy tűlyuk, amelyet megvilágítási tűlyuknak, illetve érzékelő tűlyuknak neveznek. A kettő geometriai méretei megegyeznek, körülbelül 100-200 nm; a fókuszsíkon lévő fényfolthoz viszonyítva a kettő konjugált, vagyis a fényfolt egy sor lencsén halad át, és végül egyszerre fókuszálható a megvilágító tűlyukra és az érzékelési tűlyukra. Ily módon a fókuszsíkból érkező fény az érzékelési lyukon belül koncentrálható, míg a gyújtósík feletti vagy alatti szórt fény az érzékelési lyukon kívülre kerül, és nem leképezhető. A mintát a lézerrel pontról pontra letapogatják, majd a fénysokszorozó cső a tűlyuk észlelése után pontról pontra megkapja a megfelelő fény konfokális képét is, amelyet digitális jellé alakítva továbbít a számítógépnek, végül aggregálódik a képernyőt a teljes fókuszsík tiszta konfokális képévé. .
Minden egyes fókuszsík kép valójában a minta optikai keresztmetszete, és ennek az optikai keresztmetszetnek mindig van egy bizonyos vastagsága, más néven optikai szelet. Mivel a fókuszpontban a fény intenzitása sokkal nagyobb, mint a nem fókuszpontban, és a nem fókuszsíkú fényt a tűlyuk szűri ki, a konfokális rendszer mélységélessége megközelítőleg nulla, és a pásztázás a fókuszpont mentén. A Z-tengely optikai tomográfiát valósít meg, amely a minta fókuszált pontján kétdimenziós optikai metszetet képez. Az XY sík (fókuszsík) szkennelést a Z tengelyes (optikai tengely) szkenneléssel kombinálva, az egymást követő rétegek kétdimenziós képeinek felhalmozásával és speciális számítógépes szoftverrel történő feldolgozásával háromdimenziós képe nyerhető a mintáról.
Azaz a detektáló tűlyuk és a fényforrás tűlyuk mindig ugyanarra a pontra fókuszálnak, így a fókuszsíkon kívül gerjesztett fluoreszcencia nem juthat be a detektáló tűlyukba.
A konfokális lézer működési elvének egyszerű kifejeződése, hogy fényforrásként lézert használ, és a hagyományos fluoreszcens mikroszkópos képalkotás alapján lézeres pásztázó készüléket és konjugált fókuszáló készüléket csatlakoztat, valamint a digitális képfelvételt és -feldolgozást. a rendszert számítógép vezérli.
