A fluoreszcens mikroszkóp és a normál mikroszkóp közötti különbség
Nemrég megpróbáltam fagyasztott egereket készíteni. Ezután egy fluoreszcens mikroszkóp segítségével megnézem, hogy az általam beinjektált vírus azon az agyterületen van-e, amelyet akarok. A fluoreszcens mikroszkópia néhány alapelvét röviden meg kell tanulni, és ezeket itt megosztom.
A fluoreszcens mikroszkópok ultraibolya fényt használnak fényforrásként a vizsgált tárgy megvilágítására, ami fényt bocsát ki, majd a tárgyat mikroszkóp alatt figyeli meg. Főleg immunfluoreszcens sejtekhez használják. Főleg egy fényforrásból, egy szűrőlemez-rendszerből és egy optikai rendszerből áll. A minta fluoreszcens képe a szemlencse és az objektív nagyításán keresztül figyelhető meg. Nézzük meg, mi a különbség a fluoreszcens mikroszkóp és a közönséges optikai mikroszkóp között.
1. Nézd meg a világítási módot
A fluoreszcens mikroszkóp megvilágítási módszere általában epi-illumination, ami azt jelenti, hogy a fényforrást az objektíven keresztül helyezik a vizsgált mintára.
2. Nézd meg a felbontást
A fluoreszcens mikroszkópok ultraibolya fényt használnak fényforrásként, amelynek rövidebb a hullámhossza, de nagyobb a felbontása, mint a hagyományos optikai mikroszkópoké.
3. A szűrők közötti különbségek
A fluoreszcens mikroszkópok két speciális szűrőt használnak, az egyiket a fényforrás előtt használják a látható fény kiszűrésére, a másikat pedig az objektív és a szemlencse között az ultraibolya sugarak kiszűrésére, amelyek védhetik az emberi szemet.
A fluoreszcens mikroszkóp egyfajta optikai mikroszkóp is. Ennek fő oka az, hogy a fluoreszcens mikroszkóp által gerjesztett hullámhossz rövid, így ez a fluoreszcens mikroszkóp és a közönséges mikroszkóp szerkezeti és felhasználási különbségéhez vezet. A legtöbb fluoreszcens mikroszkóp jó funkcióval rendelkezik a gyenge fény rögzítésére. , így képalkotó képessége rendkívül gyenge fluoreszcencia mellett is jó. A fluoreszcenciás mikroszkópok elmúlt évekbeli folyamatos fejlesztésével párosulva a zaj is jelentősen csökkent. Ezért egyre több fluoreszcens mikroszkóp kerül alkalmazásra.
Kétfoton fluoreszcencia mikroszkópos ismeretek
A kétfotonos gerjesztés alapelve: nagy fotonsűrűség mellett a fluoreszcens molekulák egyszerre két hosszú hullámhosszú fotont tudnak elnyelni, majd rövid, úgynevezett gerjesztett állapotú élettartam után rövidebb hullámhosszú fotont bocsátanak ki. . ;A hatás ugyanaz, mintha egy fotont használnánk a hosszú hullámhossz felénél a fluoreszcens molekulák gerjesztésére. A kétfotonos gerjesztéshez nagy fotonsűrűség szükséges. A sejtek károsodásának elkerülése érdekében a kétfotonos mikroszkópok nagy energiájú üzemmódban zárt impulzuslézereket használnak. Ez a lézer nagy csúcsenergiájú és alacsony átlagos energiájú lézerfényt bocsát ki, impulzusszélessége mindössze 100 femtoszekundum, frekvenciája pedig 80-100 MHz. Ha nagy numerikus apertúrájú objektívlencsét használunk az impulzuslézer fotonjainak fókuszálására, a fotonsűrűség az objektívlencse fókuszában a legmagasabb. A kétfotonos gerjesztés csak az objektívlencse fókuszában jelentkezik, így a kétfotonos mikroszkóphoz nincs szükség konfokális tűlyukra, ami javítja a fluoreszcencia detektálás hatékonyságát.
Az általános fluoreszcencia jelenségben a gerjesztő fény alacsony fotonsűrűsége miatt egy fluoreszcens molekula egyszerre csak egy fotont képes elnyelni, majd egy sugárzási átmeneten keresztül egy fluoreszcens fotont kibocsátani. Ez egyfoton fluoreszcencia. A lézert fényforrásként használó fluoreszcens gerjesztési eljárásnál két- vagy akár többfoton fluoreszcencia jelenség is előfordulhat. Ebben az esetben az alkalmazott gerjesztő fényforrás intenzitása nagy, a fotonsűrűség pedig megfelel annak a követelménynek, hogy a fluoreszcens molekulák egyszerre két fotont nyeljenek el. A közönséges lézerek gerjesztő fényforrásként történő felhasználása során a fotonsűrűség még mindig nem elegendő a kétfotonos abszorpció létrehozásához. Általában femtoszekundumos impulzuslézereket használnak, amelyek pillanatnyi teljesítménye elérheti a megawatt szintet. Ezért a kétfoton fluoreszcencia hullámhossza rövidebb, mint a gerjesztő fény hullámhossza, ami egyenértékű a fél gerjesztési hullámhosszú gerjesztés által keltett hatással.
