Sejtkutatási mikroszkópok osztályozása és működése
A mikroszkóp a sejtek megfigyelésének elsődleges eszköze. A különböző fényforrások szerint két kategóriába sorolható: optikai mikroszkópok és elektronmikroszkópok. Előbbi látható fényt (UV mikroszkópok ultraibolya fényt) használ fényforrásként, míg utóbbi elektronsugarat használ fényforrásként.
-,Optikai mikroszkóp
(1) Közönséges optikai mikroszkóp
A hagyományos biológiai mikroszkópok három részből állnak, nevezetesen: ① megvilágító rendszer, beleértve a fényforrást és a kondenzátort; ② optikai nagyító rendszer, amely objektívlencséből és okulárból áll, amely a mikroszkóp fő része. A szférikus aberráció és a kromatikus aberráció kiküszöbölése érdekében mind a szemlencse, mind az objektív ③Mechanikai eszköz, amely az anyag rögzítésére és a megfigyelés megkönnyítésére szolgál (2-1 ábra).
Azt, hogy a mikroszkóp képe tiszta-e, nemcsak a nagyítás határozza meg, hanem a mikroszkóp felbontása is összefügg. A felbontás arra utal, hogy a mikroszkóp (vagy az emberi szem 25 cm-re van a célponttól) képes megkülönböztetni a tárgyak közötti legkisebb távolságot. A felbontás nagyságát a fény hullámhosszának és apertúrájának aránya, valamint a közeg törésmutatója a következő képlettel fejezzük ki:
A képletben: n=a közeg törésmutatója;=rekesznyílás (a minta nyitási szöge az objektívlencse rekesznyílásához képest), NA=objektív rekesznyílás (numerikus rekesz). A lencse szöge mindig kisebb, mint 180 fok, ezért a sina/2 maximális értékének 1-nél kisebbnek kell lennie.
Az optikai lencse készítéséhez használt üveg törésmutatója 1,65-1,78, a használt közeg törésmutatója annál jobb, ha közelebb van az üveghez. Száraz objektívlencsék esetén a közeg levegő, és az objektív rekesznyílás aránya általában 0.05–0,95; olajos lencséknél cédrusolajat használnak közegként, és a lencse rekesznyílás-aránya közel 1,5 lehet.
A közönséges fény hullámhossza {{0}}nm, így a mikroszkóp felbontási értéke nem lesz kisebb 0,2μm-nél, az emberi szem felbontása pedig 0,2 mm, így a az általános mikroszkópkialakítás maximális nagyítása általában 1000X.
(2) Fluoreszcens mikroszkópia
A sejtekben lévő egyes anyagok, például a klorofill, ultraibolya sugárzás hatására fluoreszkálhatnak; egyes anyagok önmagukban nem tudnak fluoreszkálni, de ha fluoreszcens festékekkel vagy fluoreszcens antitestekkel festik meg őket, akkor ultraibolya sugárzás hatására is fluoreszkálhatnak, ennek egyik eszköze a fluoreszcens mikroszkóp (2-2. ábra, 3, 4). az ilyen anyagokkal kapcsolatos kvalitatív és kvantitatív kutatásokhoz.
A fluoreszcens mikroszkópok és a közönséges mikroszkópok a következő különbségekkel rendelkeznek:
1. A megvilágítási módszer általában epi-illumináció, vagyis a fényforrást az objektívlencsén keresztül vetítik a mintára (2-3. ábra);
2. A fényforrás ultraibolya fény, a hullámhossz rövidebb, és a felbontás nagyobb, mint a hagyományos mikroszkópoké;
3. Két speciális szűrő található, a fényforrás előtti a látható fény kiszűrésére szolgál, a szemlencse és az objektívlencse közötti pedig az ultraibolya fényt a szem védelmére.
(3) Lézeres pásztázó konfokális mikroszkóp
A lézeres konfokális pásztázó mikroszkóp (lézer konfokális pásztázó mikroszkóp, 2-5, 6. ábra) lézert használ pásztázó fényforrásként, és pontról pontra, vonalról vonalra, felületről felületre pásztázza a képalkotást, és a pásztázó lézer- és fluoreszcencia-gyűjtemény megosztja objektív lencse, és az objektív fókuszpontja A pásztázó lézer fókuszpontja egyben a pillanatnyi képalkotás tárgypontja is. Mivel a lézersugár hullámhossza rövid és a sugár nagyon vékony, a konfokális lézeres pásztázó mikroszkóp felbontása nagyobb, ami körülbelül háromszorosa egy közönséges optikai mikroszkópénak. A rendszer egyszer fókuszál, és a pásztázás a minta egy síkjára korlátozódik. Ha a fókuszmélység eltérő, akkor a mintáról különböző mélységszintű képek készíthetők. Ezeket a képadatokat a számítógép tárolja. Számítógépes elemzéssel és szimulációval megjeleníthető a sejtminta háromdimenziós szerkezete.
A konfokális lézeres pásztázó mikroszkópia nemcsak sejtmorfológia megfigyelésére, hanem intracelluláris biokémiai komponensek kvantitatív elemzésére, optikai denzitásstatisztika és sejtmorfológia mérésére is használható.
(4) Sötéttér mikroszkóp
A sötétterű mikroszkóp (sötétmezős mikroszkóp, 2-7. ábra) fénylappal rendelkezik a kondenzátor közepén, így a megvilágító fény nem jut be közvetlenül az emberi lencsébe, hanem csak a minta által visszavert és elhajló fény. behatol az objektívbe, így a látómező háttere fekete, A tárgyak szélei világosak. Ezzel a mikroszkóppal már 4-200nm-es részecskék is láthatók, a felbontás pedig 50-szer nagyobb lehet, mint a hagyományos mikroszkópoké.
(5) Fáziskontraszt mikroszkóp
P. Zernike fáziskontrasztmikroszkópját (fázikontrasztmikroszkóp, 2-8, 9. ábra) 1932-ben találta fel, és 1953-ban elnyerte érte a fizikai Nobel-díjat. Ennek a mikroszkópnak az a legnagyobb tulajdonsága, hogy képes megfigyelni festetlen mintákat és élő sejteket.
A fáziskontraszt mikroszkópia alapelve, hogy a mintán áthaladó látható fény optikai útkülönbségét amplitúdó-különbségre változtatja, ezáltal javítja a kontrasztot a különböző struktúrák között, és jól láthatóvá teszi a különböző struktúrákat. A mintán való áthaladás után a fény megtörik, eltér az eredeti optikai úttól, és 1/4λ-val (hullámhosszal) késik. Erősítse, növelje vagy csökkentse az amplitúdót, növelje a kontrasztot. Felépítését tekintve a fáziskontraszt mikroszkópok két különleges tulajdonsággal rendelkeznek, amelyek eltérnek a hagyományos optikai mikroszkópokétól:
1. A gyűrű alakú membrán a fényforrás és a kondenzátor között helyezkedik el, és feladata, hogy a kondenzátoron áthaladó fényt üreges fénykúpot képezzen, és a mintára fókuszáljon.
2. A fázislemez (gyűrű alakú fázislemez) magnézium-fluoriddal bevont fázislemezt ad az objektívlencséhez, amely 1/4λ-val késleltetheti a közvetlen fény vagy a szórt fény fázisát. Két típusa van:
①A plusz fázisú lemez: A közvetlen fény 1/4λ-kal késik. A két fényhullámcsoport egyesítése után a fényhullámok összeadódnak, és az amplitúdó megnő. A minta szerkezete világosabb, mint a környező közeg, így fényes kontrasztot (vagy negatív kontrasztot) képez.
② B plusz fázislemez: A szórt fény 1/4λ-kal késik. A két sugárkészlet kombinálása után a fényhullámokat levonják, és az amplitúdó kisebb lesz, sötét kontrasztot (vagy pozitív kontrasztot) képezve, és a szerkezet sötétebb, mint a környező közeg.
